medlitГигиена и санитарияHygiene and Sanitation0016-99002412-0650Federal Scientific Center of Hygiene named after F.F. Erisman10.47470/0016-9900-2022-101-5-562-566medlit-2277Research ArticleМЕТОДЫ ГИГИЕНИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙMETHODS OF HYGIENIC AND EXPERIMENTAL INVESTIGATIONSОпыт использования метода времяпролётной масс-спектрометрии для идентификации плесневых грибовMALDI-TOF MS application for identification of filamentous fungihttps://orcid.org/0000-0003-3152-4862КурбатоваИ. В.KurbatovaIrina V.noemail@neicon.ruhttps://orcid.org/0000-0003-3554-7690РакитинаД. В.RakitinaDarya V.noemail@neicon.ruhttps://orcid.org/0000-0002-6628-4689КравченкоЕ. С.KravchenkoEkaterina S.noemail@neicon.ruhttps://orcid.org/0000-0002-6295-661XМанияТамари РезоевнаManiyaTamari R.

Науч. сотр. лаб. микробиологии и паразитологии ФГБУ «ЦСП» ФМБА России 119121, Москва. 

e-mail: TManiya@cspmz.ru

Researcher of Microbiology and Parasitology laboratory of the Centre for Strategic Planning and Management of Biomedical Health Risks” of the Federal Medical Biological Agency, Moscow, 119121, Russia Federation.

e-mail: TManiya@cspmz.ru

tmaniya@cspmz.ruhttps://orcid.org/0000-0002-5282-3856АслановаМ. М.AslanovaMariya M.noemail@neicon.ruЮдинС. М.YudinSergey M.noemail@neicon.ruФГБУ «Центр стратегического планирования и управление медико-биологическими рисками здоровью» Федерального медико-биологического агентстваРоссияCentre for Strategic Planning and Management of Biomedical Health Risks of the Federal Medical Biological AgencyRussian Federation2022070620221015562566Copyright © Курбатова И.В., Ракитина Д.В., Кравченко Е.С., Мания Т.Р., Асланова М.М., Юдин С.М., 20222022Курбатова И.В., Ракитина Д.В., Кравченко Е.С., Мания Т.Р., Асланова М.М., Юдин С.М.Kurbatova I.V., Rakitina D.V., Kravchenko E.S., Maniya T.R., Aslanova M.M., Yudin S.M.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://www.rjhas.ru/jour/article/view/2277Введение

Введение. Метод матрично-ассоциированной лазерной масс-спектрометрии широко применяется в микробиологии в силу точности и быстроты получения результатов. Однако применение этого метода для плесневых грибов представляет ряд трудностей и не всегда эффективно.

Цель и задачи исследования — определить целесообразность практического применения удлинённого протокола с культивированием в жидкой среде и предварительной экстракцией белков в рутинной идентификации плесневых грибов, выделенных из окружающей среды.

Материалы и методы

Материалы и методы. Проводили анализ музейной коллекции плесневых грибов ФГБУ «ЦСП» ФМБА России методом MALDI-TOF-масс-спектрометрии для видовой идентификации микроорганизмов с помощью системы идентификации Biotyper (Bruker) с предварительным культивированием в жидкой среде и белковой экстракцией муравьиной кислотой и ацетонитрилом по удлинённому оптимизированному протоколу.

Результаты

Результаты. Проанализировано 137 образцов из коллекции лаборатории микробиологии и паразитологии. Качественные спектры получены для 71,5% изолятов. Идентификация по базе MBT Filamentous Fungi Library с достоверным скором (> 1,7) получена для 55% образцов (26% со скором > 2). Проанализированные образцы включали в себя представителей 19 семейств и 27 родов, 16% образцов демонстрировали спектры высокого качества, но не идентифицировались по базе MBT Filamentous Fungi Library (Bruker).

Ограничения исследования

Ограничения исследования: при изучении возможности использования метода времяпролётной масс-спектрометрии для идентификации плесневых грибов был произведён анализ 137 изолятов плесневых грибов из окружающей среды, что представляет собой достаточную референтную выборку. Проанализированные образцы включали в себя представителей 19 семейств и 27 родов, что позволяет применить полученные выводы по крайней мере к этим представителям мицелиальных грибов. В рамках данного исследования не удалось идентифицировать 22 образца со спектрами высокого качества, поэтому предметом дальнейших исследований будет их идентификация молекулярно-генетическими методами, выявление подобных образцов и создание из них новой собственной базы спектров для MALDI-TOF-биотипирования. Предстоит также расширить перечень изучаемых семейств.

Заключение

Заключение. Для эффективной идентификация плесневых грибов с помощью масс-спектрометрических методов целесообразно применять культивирование чистой культуры в жидкой среде, оптимизированный протокол пробоподготовки и создание собственной внутрилабораторной базы данных спектров.

Участие авторов

Участие авторов: Курбатова И.В. — концепция и дизайн исследования, сбор материала и микроскопическая идентификация, обработка данных, статистическая обработка, написание текста; редактирование;Ракитина Д.В. — концепция и дизайн исследования, сбор материала и обработка данных, идентификация методом MALDI-TOF, статистическая обработка, написание текста, редактирование;Кравченко Е.С. — культивирование образцов;Мания Т.Р. — написание текста, редактирование;Асланова М.М. — концепция и дизайн исследования, редактирование;Юдин С.М. — редактирование.Все соавторы — утверждение окончательного варианта статьи, ответственность за целостность всех частей статьи.

Конфликт интересов

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов в связи с публикацией данной статьи.

Финансирование

Финансирование. Исследование проводилось при поддержке Государственного задания «Разработка унифицированных методов, включающих отбор проб, для осуществления определения микробиологического и паразитологического загрязнения сточных вод» (шифр «Сточные воды») № АААА-А21-121011190012-3.

Поступила

Поступила: 05.03.2022 / Принята к печати: 12.04.2022 / Опубликована: 31.05.2022

Introduction

Introduction. MALDI-TOF identification method is widely used in microbiology due to its accuracy and rapid results achievement. However, applying this method to mold fungi faces some difficulties and is not always effective.

Purpose of the study was to evaluate the profits of using the long cultivation and protein extraction protocol in routine identification of mold fungi isolates from environment.

Materials and methods

Materials and methods. The analysis of molds museum collection from Centre for Strategic Planning of FMBA of Russia was performed by MALDI-TOF mass-spectrometry Biotyper (Bruker Daltonics) with cultivation in liquid media and long optimized protein extraction protocol with acetonitrile and formic acid.

Results

Results. One hundred thirty seven isolates were analyzed. Quality spectra were achieved for 71.5% of samples. Identification with MBT Filamentous Fungi Library database with the high confidence score (> 1.7) was achieved for 55% of isolates (26% with score > 2). Samples analyzed included members of nineteen families and 27 genera. 16% of samples were not identified despite producing high-quality spectra.

Limitations

Limitations. When studying the possibility of using the time-of-flight mass spectrometry method to identify mold fungi, a sample of 137 isolates of mold fungi from the environment was analyzed, which is a sufficient reference sample. The analyzed samples included representatives of 19 families and 27 genera, which makes it possible to apply the findings to at least these representatives of micellar fungi. In this study 22 samples with good quality spectra, were not identified with MBT Filamentous Fungi Library database. In the future studies, these samples, along with other samples like that, will be identified by genetic molecular methods and added to the new home-made database for filamentous fungi MALDI-TOF identification.

Conclusion

Conclusion. Effective identification of filamentous fungi by mass-spectrometry methods requires pure culture achieved from liquid media, long optimized protocol of protein extraction and building an in-house database of spectra not presented in Bruker database.

Contribution

Contribution: Kurbatova I.V. — research concept and design, material collection and microscopic identification data processing, statistical processing, text writing, editing;Rakitina D.V. — research concept and design, material collection and data processing, identification by MALDI-TOF statistical processing, text writing, editing;Kravchenko E.S. — cultivation of samples;Maniya T.R. — writing text, editing;Aslanova M.M. — concept and design of the study, editing;Yudin S.M. — editing.All authors are responsible for the integrity of all parts of the manuscript and approval of the manuscript final version.

Conflict of interest

Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.

Acknowledgments

Acknowledgments. The research was carried out with the support of the State Assignment Reg. No. АААА-А21-121011190012-3, theme “Development of unified methods, including sampling, for the determination of microbiological and parasitological contamination of wastewater” (code “Wastewater”).

Received

Received: March 5, 2022 / Accepted: April 12, 2022 / Published: May 31, 2022

MALDI-TOF MSплесневые грибыMALDI-TOF MSmold fingiReferencesPatel R. MALDI-TOF mass spectrometry: transformative proteomics for clinical microbiology. Clin. Chem. 2013; 59(2): 340-2. https://doi.org/10.1373/clinchem.2012.183558Patel R. MALDI-TOF mass spectrometry: transformative proteomics for clinical microbiology. Clin. Chem. 2013; 59(2): 340–2. https://doi.org/10.1373/clinchem.2012.183558McElvania TeKippe E., Burnham C.A. Evaluation of the Bruker Biotyper and VITEK MS MALDI-TOF MS systems for the identification of unusual and/or difficult-to-identify microorganisms isolated from clinical specimens. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 2014; 33(12): 2163-71. https://doi.org/10.1007/s10096-014-2183-yMcElvania TeKippe E., Burnham C.A. Evaluation of the Bruker Biotyper and VITEK MS MALDI-TOF MS systems for the identification of unusual and/or difficult-to-identify microorganisms isolated from clinical specimens. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 2014; 33(12): 2163–71. https://doi.org/10.1007/s10096-014-2183-yBilecen K., Yaman G., Ciftci U., Laleli Y.R. Performances and reliability of Bruker Microflex LT and VITEK MS MALDI-TOF mass spectrometry systems for the identification of clinical microorganisms. Biomed Res.Int. 2015; 2015: 516410. https://doi.org/10.1155/2015/516410Bilecen K., Yaman G., Ciftci U., Laleli Y.R. Performances and reliability of Bruker Microflex LT and VITEK MS MALDI-TOF mass spectrometry systems for the identification of clinical microorganisms. Biomed Res. Int. 2015; 2015: 516410. https://doi.org/10.1155/2015/516410Levesque S., Dufresne P.J., Soualhine H., Domingo M.C., Bekal S., Lefebvre B., et al. A side by side comparison of Bruker Biotyper and VITEK MS: Utility of MALDI-TOF MS technology for microorganism identification in a public health reference laboratory. PLoS One. 2015; 10(12): e0144878. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0144878Levesque S., Dufresne P.J., Soualhine H., Domingo M.C., Bekal S., Lefebvre B., et al. A side by side comparison of Bruker Biotyper and VITEK MS: Utility of MALDI-TOF MS technology for microorganism identification in a public health reference laboratory. PLoS One. 2015; 10(12): e0144878. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0144878Chen Y., Prior B.A., Shi G., Wang Z. A rapid PCR-based approach for molecular identification of filamentous fungi. J. Microbiol. 2011; 49(4): 675-9. https://doi.org/10.1007/s12275-011-0525-3Chen Y., Prior B.A., Shi G., Wang Z. A rapid PCR-based approach for molecular identification of filamentous fungi. J. Microbiol. 2011; 49(4): 675–9. https://doi.org/10.1007/s12275-011-0525-3Diguta C.F., Vincent B., Guilloux-Benatier M., Alexandre H., Rousseaux S. PCR ITS-RFLP: A useful method for identifying filamentous fungi isolates on grapes. Food Microbiol. 2011; 28(6): 1145-54. https://doi.org/10.1016/j.fm.2011.03.006Diguta C.F., Vincent B., Guilloux-Benatier M., Alexandre H., Rousseaux S. PCR ITS-RFLP: A useful method for identifying filamentous fungi isolates on grapes. Food Microbiol. 2011; 28(6): 1145–54. https://doi.org/10.1016/j.fm.2011.03.006Ferrer C., Colom F., Frasés S., Mulet E., Abad J.L., Alió J.L. Detection and identification of fungal pathogens by PCR and by ITS2 and 5.8S ribosomal DNA typing in ocular infections. J. Clin. Microbiol. 2001; 39(8): 2873-9. https://doi.org/10.1128/JCM.39.8.2873-2879.2001Ferrer C., Colom F., Frasés S., Mulet E., Abad J.L., Alió J.L. Detection and identification of fungal pathogens by PCR and by ITS2 and 5.8S ribosomal DNA typing in ocular infections. J. Clin. Microbiol. 2001; 39(8): 2873–9. https://doi.org/10.1128/JCM.39.8.2873-2879.2001Normand A.C., Cassagne C., Gautier M., Becker P., Ranque S., Hendrickx M., et al. Decision criteria for MALDI-TOF MS-based identification of filamentous fungi using commercial and in-house reference databases. BMC Microbiol. 2017; 17(1): 25. https://doi.org/10.1186/s12866-017-0937-2Normand A.C., Cassagne C., Gautier M., Becker P., Ranque S., Hendrickx M., et al. Decision criteria for MALDI-TOF MS-based identification of filamentous fungi using commercial and in-house reference databases. BMC Microbiol. 2017; 17(1): 25. https://doi.org/10.1186/s12866-017-0937-2Gómez-Velásquez J.C., Loaiza-Díaz N., Norela Hernández G., Lima N., Mesa-Arango A.C. Development and validation of an in-house library for filamentous fungi identification by MALDI-TOF MS in a clinical laboratory in Medellin (Colombia). Microorganisms. 2020; 8(9): 1362. https://doi.org/10.3390/microorganisms8091362Gómez-Velásquez J.C., Loaiza-Díaz N., Norela Hernández G., Lima N., Mesa-Arango A.C. Development and validation of an in-house library for filamentous fungi identification by MALDI-TOF MS in a clinical laboratory in Medellin (Colombia). Microorganisms. 2020; 8(9): 1362. https://doi.org/10.3390/microorganisms8091362Zvezdanova M.E., Escribano P., Ruiz A., Martínez-Jiménez M.C., Peláez T., Collazos A., et al. Increased species-assignment of filamentous fungi using MALDI-TOF MS coupled with a simplified sample processing and an in-house library. Med. Mycol. 2019; 57(1): 63-70. https://doi.org/10.1093/mmy/myx154Zvezdanova M.E., Escribano P., Ruiz A., Martínez-Jiménez M.C., Peláez T., Collazos A., et al. Increased species-assignment of filamentous fungi using MALDI-TOF MS coupled with a simplified sample processing and an in-house library. Med. Mycol. 2019; 57(1): 63–70. https://doi.org/10.1093/mmy/myx154Stein M., Tran V., Nichol K.A., Lagacé-Wiens P., Pieroni P., Adam H.J., et al. Evaluation of three MALDI-TOF mass spectrometry libraries for the identification of filamentous fungi in three clinical microbiology laboratories in Manitoba, Canada. Mycoses. 2018; 61(10): 743-53. https://doi.org/10.1111/myc.12800Stein M., Tran V., Nichol K.A., Lagacé-Wiens P., Pieroni P., Adam H.J., et al. Evaluation of three MALDI-TOF mass spectrometry libraries for the identification of filamentous fungi in three clinical microbiology laboratories in Manitoba, Canada. Mycoses. 2018; 61(10): 743–53. https://doi.org/10.1111/myc.12800Wilkendorf L.S., Bowles E., Buil J.B., van der Lee H.A.L., Posteraro B., Sanguinetti M., et al. Update on matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry identification of filamentous fungi. J. Clin. Microbiol. 2020; 58(12): e01263-20. https://doi.org/10.1128/JCM.01263-20Wilkendorf L.S., Bowles E., Buil J.B., van der Lee H.A.L., Posteraro B., Sanguinetti M., et al. Update on matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry identification of filamentous fungi. J. Clin. Microbiol. 2020; 58(12): e01263–20. https://doi.org/10.1128/JCM.01263-20Cassagne C., Ranque S., Normand A.C., Fourquet P., Thiebault S., Planard C., et al. Mould routine identification in the clinical laboratory by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry. PLoS One. 2011; 6(12): e28425. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0028425Cassagne C., Ranque S., Normand A.C., Fourquet P., Thiebault S., Planard C., et al. Mould routine identification in the clinical laboratory by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry. PLoS One. 2011; 6(12): e28425. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0028425Chabasse B. Emergence of new fungal pathogens: general review. Rev. Francoph. Lab. 2009; 416: 71-87.Chabasse B. Emergence of new fungal pathogens: general review. Rev. Francoph. Lab. 2009; 416: 71–87.Peng Y., Zhang Q., Xu C., Shi W. MALDI-TOF MS for the rapid identification and drug susceptibility testing of filamentous fungi. Exp. Ther. Med. 2019; 18(6): 4865-73. https://doi.org/10.3892/etm.2019.8118Peng Y., Zhang Q., Xu C., Shi W. MALDI-TOF MS for the rapid identification and drug susceptibility testing of filamentous fungi. Exp. Ther. Med. 2019; 18(6): 4865–73. https://doi.org/10.3892/etm.2019.8118Hendrickx M. MALDI-TOF MS and filamentous fungal identification: a success story? Curr. Fungal Inf. Rep. 2017; 11(2): 60-5. https://doi.org/10.1007/s12281-017-0277-6Hendrickx M. MALDI-TOF MS and filamentous fungal identification: a success story? Curr. Fungal Inf. Rep. 2017; 11(2): 60–5. https://doi.org/10.1007/s12281-017-0277-6Reeve M.A., Bachmann D. A method for filamentous fungal growth and sample preparation aimed at more consistent MALDI-TOF MS spectra despite variations in growth rates and/or incubation times. Biol. Methods. Protoc. 2019; 4(1): bpz003. https://doi.org/10.1093/biomethods/bpz003Reeve M.A., Bachmann D. A method for filamentous fungal growth and sample preparation aimed at more consistent MALDI-TOF MS spectra despite variations in growth rates and/or incubation times. Biol. Methods. Protoc. 2019; 4(1): bpz003. https://doi.org/10.1093/biomethods/bpz003Билай В.И., Коваль Э.З. Аспергиллы. Определитель. Киев: Наукова Думка; 1988.Bilay V.I., Koval’ E.Z. Aspergilli. The Determinant [Aspergilly. Opredelitel’]. Kiev: Naukova Dumka; 1988. (in Russian)Билай В.И., Курбацкая З.А. Определитель токсинобразующих микромицетов. Киев: Наукова Думка; 1990.Bilay V.I., Kurbatskaya Z.A. Determinant of Toxin-Forming Micromycetes [Opredelitel’ toksinobrazuyushchikh mikromitsetov]. Kiev: Naukova Dumka; 1990. (in Russian)Саттон Д., Фотергилл А., Ринальди М. Определитель патогенных и 103 условно патогенных грибов. М.: Мир; 2001.Satton D., Fotergill A., Rinal’di M. Determinant of Pathogenic and 103 Conditionally Pathogenic Fungi [Opredelitel’ patogennykh i 103 uslovno patogennykh gribov]. Moscow: Mir; 2001. (in Russian)Booth С. The genus Fusarium.Commonwealth Mycological Inst. Kew, Surrey; 1971.Booth С. The genus Fusarium. Commonwealth Mycological Inst. Kew, Surrey; 1971.Pitt J.I. A Laboratory Guide to Common Penicillium Species.Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization. North Wales; 1991.Pitt J.I. A Laboratory Guide to Common Penicillium Species. Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization. North Wales; 1991.Schulthess B., Ledermann R., Mouttet F., Zbinden A., Bloemberg G.V., Böttger E.C., et al. Use of the Bruker MALDI Biotyper for identification of molds in the clinical mycology laboratory. J. Clin. Microbiol. 2014; 52(8): 2797-803. https://doi.org/10.1128/JCM.00049-14.Schulthess B., Ledermann R., Mouttet F., Zbinden A., Bloemberg G.V., Böttger E.C., et al. Use of the Bruker MALDI Biotyper for identification of molds in the clinical mycology laboratory. J. Clin. Microbiol. 2014; 52(8): 2797–803. https://doi.org/10.1128/JCM.00049-14Ning Y.T., Yang W.H., Zhang W., Xiao M., Wang Y., Zhang J.J., et al. Developing two rapid protein extraction methods using focused-ultrasonication and zirconia-silica beads for filamentous fungi identification by MALDI-TOF MS. Front. Cell. Infect. Microbiol. 2021; 11: 687240. https://doi.org/10.3389/fcimb.2021.687240Ning Y.T., Yang W.H., Zhang W., Xiao M., Wang Y., Zhang J.J., et al. Developing two rapid protein extraction methods using focused-ultrasonication and zirconia-silica beads for filamentous fungi identification by MALDI-TOF MS. Front. Cell. Infect. Microbiol. 2021; 11: 687240. https://doi.org/10.3389/fcimb.2021.687240Patel R. A moldy application of MALDI: MALDI-ToF mass spectrometry for fungal identification. J. Fungi (Basel). 2019; 5(1): 4. https://doi.org/10.3390/jof5010004Patel R. A moldy application of MALDI: MALDI-ToF mass spectrometry for fungal identification. J. Fungi (Basel). 2019; 5(1): 4. https://doi.org/10.3390/jof5010004Becker P.T., de Bel A., Martiny D., Ranque S., Piarroux R., Cassagne C., et al. Identification of filamentous fungi isolates by MALDI-TOF mass spectrometry: clinical evaluation of an extended reference spectra library. Med. Mycol. 2014; 52(8): 826-34. https://doi.org/10.1093/mmy/myu064Becker P.T., de Bel A., Martiny D., Ranque S., Piarroux R., Cassagne C., et al. Identification of filamentous fungi isolates by MALDI-TOF mass spectrometry: clinical evaluation of an extended reference spectra library. Med. Mycol. 2014; 52(8): 826–34. https://doi.org/10.1093/mmy/myu06

The authors declare that there are no conflicts of interest present.