medlitГигиена и санитарияHygiene and Sanitation0016-99002412-0650Federal Scientific Center of Hygiene named after F.F. Erisman10.47470/0016-9900-2022-101-5-567-571medlit-2278Research ArticleМЕТОДЫ ГИГИЕНИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙMETHODS OF HYGIENIC AND EXPERIMENTAL INVESTIGATIONSМетодика выделения ДНК из образцов почвыThe method of DNA extraction from soil sampleshttps://orcid.org/0000-0003-3554-7690РакитинаД. В.RakitinaDarya V.noemail@neicon.ruhttps://orcid.org/0000-0002-5282-3856АслановаМ. М.AslanovaMariya M.noemail@neicon.ruhttps://orcid.org/0000-0002-6295-661XМанияТамари РезоевнаManiyaTamari R.

Науч. сотр. лаб. микробиологии и паразитологии ФГБУ «ЦСП» ФМБА России, 119121, Москва.

e-mail: TManiya@cspmz.ru

Researcher of Microbiology and Parasitology laboratory of the Centre for Strategic Planning and Management of Biomedical Health Risks of the Federal Medical Biological Agency, Moscow, 119121, Russian Federation.

e-mail: TManiya@cspmz.ru

tmaniya@cspmz.ruФГБУ «Центр стратегического планирования и управление медико-биологическими рисками здоровью» Федерального медико-биологического агентстваРоссияCentre for Strategic Planning and Management of Biomedical Health Risks of the Federal Medical Biological AgencyRussian Federation2022070620221015567571Copyright © Ракитина Д.В., Асланова М.М., Мания Т.Р., 20222022Ракитина Д.В., Асланова М.М., Мания Т.Р.Rakitina D.V., Aslanova M.M., Maniya T.R.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://www.rjhas.ru/jour/article/view/2278Введение

Введение. Даже в городских условиях человек находится в постоянном контакте с почвой как объектом окружающей среды. При этом с почвенным загрязнением могут переноситься различные патогены, в том числе и опасные для животных и человека. В связи с этим остро стоит вопрос разработки методик для совершенствования мониторинга таких патогенных объектов. Метод ПЦР широко применяется в лабораторной практике, позволяя выявить и некультивируемые типы патогенов.

Цели и задачи — подобрать методику эффективного выделения из почвенных образцов ДНК, пригодной для проведения ПЦР-анализа.

Материалы и методы

Материалы и методы. Выделение ДНК из образцов поверхностного слоя дерново-подзолистого грунта проводили с использованием как химических реактивов, так и готовых коммерческих (но не специализированных) наборов. ПЦР-анализ проводили методом детекции в режиме реального времени.

Результаты

Результаты. Проанализировано четыре основных метода выделения ДНК из почвы в различных сочетаниях друг с другом и с тремя видами предварительной и постобработки. Хотя ДНК выделялась из почвы всеми методами, но без дополнительной очистки она была непригодна для постановки ПЦР. Показана необходимость обработки образцов солями кальция для удаления гуминовых кислот, ингибирующих ПЦР. В результате выбраны два метода выделения ДНК из почвы. В обоих первые стадии сочетали метод с использованием бромида цетримония (CTAB) и предобработку CaCO3. Более чувствительный и более дешёвый метод предполагает на третьей стадии постобработку CaCl2. Другой метод сильно уступает в чувствительности, но выигрывает в воспроизводимости, при его использовании третья стадия включает очистку на колонках из набора Qiagen.

Ограничения исследования

Ограничения исследования. При отработке методики выделения ДНК для ПЦР-анализа были изучены образцы только одного типа почв — дерново-подзолистого грунта. Поэтому методика может быть применена только для этого типа почв.

Заключение

Заключение. Разработанные методы применимы при оценке с применением метода ПЦР загрязнённости почв дерново-подзолистого типа патогенными организмами.

Участие авторов

Участие авторов: Ракитина Д.В. — концепция и дизайн исследования, отбор образцов, написание текста, выделение ДНК и ПЦР-анализ;Асланова М.М. — концепция и дизайн исследования, отбор образцов, написание текста;Мания Т.Р. — редактирование.Все соавторы — утверждение окончательного варианта статьи, ответственность за целостность всех частей статьи.

Конфликт интересов

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов в связи с публикацией данной статьи.

Финансирование

Финансирование. Исследование проведено в рамках НИР «Разработка унифицированных методов, включающих отбор проб, для осуществления определения микробиологического и паразитологического загрязнения сточных вод» (шифр «Сточные воды») АААА-А21-121011190012-3.

Поступила

Поступила: 09.02.2022 / Принята к печати: 21.04.2022 / Опубликована: 31.05.2022

Introduction

Introduction. Even in the modern urban environment humans are in constant direct and indirect contact with soil. This leads to the spread of a wide range of soil-transmitted human and animal pathogens. Therefore, the development of fast and inexpensive methods of analysis and monitoring of these pathogenic objects is of great importance. PCR method is widely applied in laboratory practice and is able to detect even the uncultivated types of pathogens. 

The aim of the study was to optimize the method of DNA isolation from soil, making it suitable for PCR-assay. 

Materials and methods

Materials and methods. DNA was isolated from the samples of surface layer of forest soil rich in humus, using lab-shelf chemicals and/or commercial kit. RT-PCR-test was performed using universal bacterial primers. 

Results

Results. We have analyzed various combinations of four extraction methods and three pre- and post-treatment methods. DNA was efficiently extracted by all methods, however, without additional purification stages it was unsuitable for PCR. The calcium salts treatment ws demonstrated to be necessary for removal of PCR inhibitors, presumably humic acids. Two DNA isolation methods were developed. Both methods use incubation with CaCO3 suspension followed by cetrimonium bromide lysis. More sensitive and unexpensive method uses CaCl2 as an additional purification stage. The less sensitive but more reproducible method included DNA isolation on Qiagen DNA (Qiagen) columns. 

Limitations

Limitations. When working out the technique of DNA isolation for PCR analysis, samples of the only sod-podzolic soil were studied. Therefore, the technique can be applied only for this type of soil. 

Conclusion

Conclusion. Both methods optimized in this study can be used for evaluation of soil samples for the presence of pathogens by PCR. 

Contribution

Contribution:Rakitina D.V. — concept and design of research, sampling, writing text, DNA isolation and PCR analysis.Aslanova M.M. — concept and design of research, sampling, writing text.Maniya T.R. — editing.All authors are responsible for the integrity of all parts of the manuscript and approval of the manuscript final version.

Conflict of interest

Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.

Acknowledgment

Acknowledgment. The research was carried out within the framework of the research work «Development of unified methods, including sampling, for the determination of microbiological and parasitological contamination of wastewater” (code “Wastewater”) No. 145.001.21.6 dated 12.11.2021.

Received

Received: February 02, 2022 / Accepted: April 21, 2022 / Published: May 31, 2022

почваДНКПЦРкальцийCTABsoilDNAPCRcalciumCTABReferencesSteffan J.J., Derby J.A., Brevik E.C. Soil pathogens that may potentially cause pandemics, including severe acute respiratory syndrome (SARS) coronaviruses. Curr. Opin. Environ. Sci. Health. 2020; 17: 35-40. https://doi.org/10.1016/j.coesh.2020.08.005Steffan J.J., Derby J.A., Brevik E.C. Soil pathogens that may potentially cause pandemics, including severe acute respiratory syndrome (SARS) coronaviruses. Curr. Opin. Environ. Sci. Health. 2020; 17: 35-40. https://doi.org/10.1016/j.coesh.2020.08.005Jourdan P.M., Lamberton P.H.L., Fenwick A., Addiss D.G. Soil-transmitted helminth infections. Lancet. 2018; 391(10117): 252-65. https://doi.org/10.1016/S0140-6736(17)31930-XJourdan P.M., Lamberton P.H.L., Fenwick A., Addiss D.G. Soil-transmitted helminth infections. Lancet. 2018; 391(10117): 252-65. https://doi.org/10.1016/S0140-6736(17)31930-XZhou J., Bruns M.A., Tiedje J.M. DNA recovery from soils of diverse composition. Appl. Environ. Microbiol. 1996; 62(2): 316-22. https://doi.org/10.1128/aem.62.2.316-322.1996Zhou J., Bruns M.A., Tiedje J.M. DNA recovery from soils of diverse composition. Appl. Environ. Microbiol. 1996; 62(2): 316-22. https://doi.org/10.1128/aem.62.2.316-322.1996Schrader C., Schielke A., Ellerbroek L., Johne R. PCR inhibitors - occurrence, properties and removal. J. Appl. Microbiol. 2012; 113(5): 1014-26. https://doi.org/10.1111/j.1365-2672.2012.05384.xSchrader C., Schielke A., Ellerbroek L., Johne R. PCR inhibitors - occurrence, properties and removal. J. Appl. Microbiol. 2012; 113(5): 1014-26. https://doi.org/10.1111/j.1365-2672.2012.05384.xPorebski S., Bailey L.G., Baum B.R. Modification of a CTAB DNA extraction protocol for plants containing high polysaccharide and polyphenol components. Plant Mol. Biol. Rep. 1997; 15(1): 8-15. https://doi.org/10.1007/BF02772108Porebski S., Bailey L.G., Baum B.R. Modification of a CTAB DNA extraction protocol for plants containing high polysaccharide and polyphenol components. Plant Mol. Biol. Rep. 1997; 15(1): 8-15. https://doi.org/10.1007/BF02772108Verma S.K., Singh H., Sharma P.C. An improved method suitable for isolation of high-quality metagenomic DNA from diverse soils. 3 Biotech. 2017; 7(3): 171. https://doi.org/10.1007/s13205-017-0847-xVerma S.K., Singh H., Sharma P.C. An improved method suitable for isolation of high-quality metagenomic DNA from diverse soils. 3 Biotech. 2017; 7(3): 171. https://doi.org/10.1007/s13205-017-0847-xYeates C., Gillings M. Rapid purification of DNA from soil for molecular biodiversity analysis. Lett. Appl. Microbiol. 1998; 27(1): 49-53. https://doi.org/10.1046/j.1472-765X.1998.00383.xYeates C., Gillings M. Rapid purification of DNA from soil for molecular biodiversity analysis. Lett. Appl. Microbiol. 1998; 27(1): 49-53. https://doi.org/10.1046/j.1472-765X.1998.00383.xSagova-Mareĉkova M., Cermak L., Novotna J., Plhackova K., Forstova J., Kopecky J. Innovative methods for soil DNA purification tested in soils with widely differing characteristics. Appl. Environ. Microbiol. 2008; 74(9): 2902-7. https://doi.org/10.1128/AEM.02161-07Sagova-Mareĉkova M., Cermak L., Novotna J., Plhackova K., Forstova J., Kopecky J. Innovative methods for soil DNA purification tested in soils with widely differing characteristics. Appl. Environ. Microbiol. 2008; 74(9): 2902-7. https://doi.org/10.1128/AEM.02161-07Charlop-Powers Z., Pregitzer C.C., Lemetre C., Ternei M.A., Maniko J., Hover B.M., et al. Urban Park soil microbiomes are a rich reservoir of natural product biosynthetic diversity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2016; 113(51): 14811-6. https://doi.org/10.1073/pnas.1615581113Charlop-Powers Z., Pregitzer C.C., Lemetre C., Ternei M.A., Maniko J., Hover B.M., et al. Urban Park soil microbiomes are a rich reservoir of natural product biosynthetic diversity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2016; 113(51): 14811-6. https://doi.org/10.1073/pnas.1615581113Braid M.D., Daniels L.M., Kitts C.L. Removal of PCR inhibitors from soil DNA by chemical flocculation. J. Microbiol. Methods. 2003; 52(3): 389-93. https://doi.org/10.1016/s0167-7012(02)00210-5Braid M.D., Daniels L.M., Kitts C.L. Removal of PCR inhibitors from soil DNA by chemical flocculation. J. Microbiol. Methods. 2003; 52(3): 389-93. https://doi.org/10.1016/s0167-7012(02)00210-5Sharma S., Sharma K.K., Kuhad R.C. An efficient and economical method for extraction of DNA amenable to biotechnological manipulations, from diverse soils and sediments. J. Appl. Microbiol. 2014; 116(4): 923-33. https://doi.org/10.1111/jam.12420Sharma S., Sharma K.K., Kuhad R.C. An efficient and economical method for extraction of DNA amenable to biotechnological manipulations, from diverse soils and sediments. J. Appl. Microbiol. 2014; 116(4): 923-33. https://doi.org/10.1111/jam.12420Barbarić L., Bačić I., Grubić Z. Powdered activated carbon: an alternative approach to genomic DNA purification. J. Forensic. Sci. 2015; 60(4): 1012-5. https://doi.org/10.1111/1556-4029.12773Barbarić L., Bačić I., Grubić Z. Powdered activated carbon: an alternative approach to genomic DNA purification. J. Forensic. Sci. 2015; 60(4): 1012-5. https://doi.org/10.1111/1556-4029.12773Herlemann D.P.R., Labrenz M., Juergens K., Bertilsson S., Waniek J.J., Anderrson A.F. Transition in bacterial communities along the 2000 km salinity gradient of the Baltic Sea. ISME J. 2011; 5(10): 1571-9. https://doi.org/10.1038/ismej.2011.41Herlemann D.P.R., Labrenz M., Juergens K., Bertilsson S., Waniek J.J., Anderrson A.F. Transition in bacterial communities along the 2000 km salinity gradient of the Baltic Sea. ISME J. 2011; 5(10): 1571-9. https://doi.org/10.1038/ismej.2011.41Bürgmann H., Pesaro M., Widmer F., Zeyer J. A strategy for optimizing quality and quantity of DNA extracted from soil. J. Microbiol. Methods. 2001; 45(1): 7-20. https://doi.org/10.1016/s0167-7012(01)00213-5Bürgmann H., Pesaro M., Widmer F., Zeyer J. A strategy for optimizing quality and quantity of DNA extracted from soil. J. Microbiol. Methods. 2001; 45(1): 7-20. https://doi.org/10.1016/s0167-7012(01)00213-5Baidoo R., Yan G., Nelson B., Skantar A.M., Chen S. Use of chemical flocculation and nested PCR for Heterodera glycines detection in DNA extracts from field soils with low population densities. Plant Dis. 2017; 101(7): 1153-61. https://doi.org/10.1094/PDIS-08-16-1163-REBaidoo R., Yan G., Nelson B., Skantar A.M., Chen S. Use of chemical flocculation and nested PCR for Heterodera glycines detection in DNA extracts from field soils with low population densities. Plant Dis. 2017; 101(7): 1153-61. https://doi.org/10.1094/PDIS-08-16-1163-REMiller D.N., Bryant J.E., Madsen E.L., Ghiorse W.C. Evaluation and optimization of DNA extraction and purification procedures for soil and sediment samples. Appl. Environ. Microbiol. 1999; 65(11): 4715-24. https://doi.org/10.1128/aem.65.11.4715-4724.1999Miller D.N., Bryant J.E., Madsen E.L., Ghiorse W.C. Evaluation and optimization of DNA extraction and purification procedures for soil and sediment samples. Appl. Environ. Microbiol. 1999; 65(11): 4715-24. https://doi.org/10.1128/aem.65.11.4715-4724.1999Frostegård A., Courtois S., Ramisse V., Clerc S., Bernillon D., Le Gall F., et al. Quantification of bias related to the extraction of DNA directly from soils. Appl. Environ. Microbiol. 1999; 65(12): 5409-20. https://doi.org/10.1128/aem.65.12.5409-5420.1999Frostegård A., Courtois S., Ramisse V., Clerc S., Bernillon D., Le Gall F., et al. Quantification of bias related to the extraction of DNA directly from soils. Appl. Environ. Microbiol. 1999; 65(12): 5409-20. https://doi.org/10.1128/aem.65.12.5409-5420.1999He J., Xua Z., Hughes J. Pre-lysis washing improves DNA extraction from a forest soil. Soil Biol. Biochem. 2005; 37(12): 2337-41. https://doi.org/10.1016/j.soilbio.2005.04.016He J., Xua Z., Hughes J. Pre-lysis washing improves DNA extraction from a forest soil. Soil Biol. Biochem. 2005; 37(12): 2337-41. https://doi.org/10.1016/j.soilbio.2005.04.016

The authors declare that there are no conflicts of interest present.