medlitГигиена и санитарияHygiene and Sanitation0016-99002412-0650Federal Scientific Center of Hygiene named after F.F. Erisman10.47470/0016-9900-2022-101-11-1386-1392medlit-2711Research ArticleМЕТОДЫ ГИГИЕНИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙMETHODS OF HYGIENIC AND EXPERIMENTAL INVESTIGATIONSНовые возможности теста Эймса при оценке мутагенности технических продуктов действующих веществ пестицидовNew possibilities of the Ames test for evaluation of mutagenicity of technical products of active ingredients of pesticideshttps://orcid.org/0000-0003-4748-8771ЕгороваОльга ВалерьевнаEgorovaOlga V.

Канд. биол. наук, вед. науч. сотр. отд. генетической токсикологии, ФБУН «ФНЦГ им. Ф.Ф. Эрисмана» Роспотребнадзора, Мытищи.

e-mail: egorovaov@fferisman.ru

MD, PhD, senior researcher of the department of genetic toxicology, F.F. Erisman Federal Scientific Center of Hygiene of the Federal Service for Surveillance on Consumer Rights Protection and Human Wellbeing, Mytishchi, 141014, Russian Federation.

e-mail: egorovaov@fferisman.ru

egorovaov@fferisman.ruhttps://orcid.org/0000-0001-9122-9465ИлюшинаН. А.IlyushinaNatalia A.noemail@neicon.ruФБУН «Федеральный научный центр гигиены имени Ф.Ф. Эрисмана» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человекаРоссияFederal Scientific Center of Hygiene named after F.F. Erisman of the Federal Service for Surveillance on Consumer Rights Protection and Human WellbeingRussian Federation2022261220221011113861392Copyright © Егорова О.В., Илюшина Н.А., 20222022Егорова О.В., Илюшина Н.А.Egorova O.V., Ilyushina N.A.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://www.rjhas.ru/jour/article/view/2711Введение

Введение. Тест Эймса — один из наиболее востребованных методов выявления мутагенности факторов среды. В ряде случаев его предлагают в качестве единственного и достаточного метода для первого этапа оценки эквивалентности технических продуктов (ТП) пестицидов оригинальным действующим веществам (ДВ). Ограничением метода является невозможность объективной оценки эквивалентности некоторых ТП, обладающих высокой цитотоксичностью, в частности сульфонилмочевин и триазолпиримидинов. С учётом механизма действия химических веществ указанных классов предложена модификация протокола стандартного чашечного теста Эймса для увеличения максимальной нецитотоксичной концентрации вплоть до 5 мг/чашка, рекомендованной нормативными документами.

Материалы и методы

Материалы и методы. Использовали 5 штаммов Salmonella typhimurium — TA97, TA98, ТА100, TA1535, TA102. Модификация метода включала обогащение верхнего агара изолейцином (1–5 мМ).

Результаты

Результаты. Максимальные нецитотоксичные концентрации тифенсульфурон-метила и флорасулама при использовании общепринятого протокола не превышали 0,05–0,125 мг/чашка. Обогащение среды изолейцином позволяло провести оценку мутагенной активности веществ вплоть до максимальной рекомендованной концентрации 5 мг/чашка. Число спонтанных ревертантных колоний находилось в пределах исторического контроля в лаборатории, полученного в стандартных условиях. Положительные контроли проявили выраженную мутагенную активность на всех штаммах в условиях метаболической активации и без неё (р ≤ 0,05).

Ограничения исследования

Ограничения исследования. Исследование ограничено тестированием мутагенной активности ТП ДВ пестицидов — ингибиторов синтазы ацетогидроксикислот.

Заключение

Заключение. Использование модифицированного протокола теста Эймса для исследования мутагенности ТП ДВ пестицидов из классов сульфонилмочевин и триазолпиримидинов путём обогащения среды изолейцином является более объективным способом оценки их мутагенности. Предложенный протокол расширяет возможности выявления опасных мутагенных примесей, которые присутствуют в ТП в небольших количествах, но при попадании в окружающую среду могут приводить к превышению уровня мутирования у живых организмов.

Участие авторов

Участие авторов: Егорова О.В. — концепция и дизайн исследования, сбор и обработка материала, написание текста; Илюшина Н.А. — статистическая обработка материала, редактирование текста. Все соавторы — утверждение окончательного варианта статьи, ответственность за целостность всех частей статьи.

Конфликт интересов

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов в связи с публикацией данной статьи.

Финансирование

Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки.

Поступила

Поступила: 21.06.2022 / Принята к печати: 03.10.2022 / Опубликована: 30.11.2022

Introduction

Introduction. The Ames test is the one of the most popular methods for mutagenicity evaluation of environmental factors. In some cases, this method is suggested to be the only and sufficient assay for the first stage of the equivalence assessment of pesticide technical grade active ingredients (TGAI) to the original products. A limitation of the Ames test is related to the impossibility of an objective equivalence assessment of some cytotoxic TGAIs, in particular, sulfonylureas, and triazolpyrimidines. Based on the mode of action of the pesticides belongs to these chemical classes, we suggested a modification of the plate incorporation method protocol of the Ames test to the increase of maximal non-cytotoxic concentration up to the 5 mg/plate recommended by regulatory documents.

Materials and methods

Materials and methods. The five strains of Salmonella typhimurium ТА98, ТА100, ТА1535, ТА97, ТА102 were used. The modification of the protocol included a supplementation of the top agar with isoleucine (1–5 mM).

Results

Results. The maximum non-cytotoxic concentrations of thifensulfuron-methyl and florasulam using the standard top agar did not exceed 0.05–0.125 mg/plate. The enrichment of the top agar with isoleucine allowed evaluating the mutagenicity of the substances up to the maximal recommended concentration of 5.0 mg/plate. The number of spontaneous revertants was within the historical limits of the laboratory control obtained under standard conditions. Positive controls showed pronounced mutagenic effects in case of all strains with and without metabolic activation (p≤0.05).

Limitations

Limitations. Mutagenicity was evaluated only for TGAIs, which are acetohydroxyacid synthase inhibitors.

Conclusion

Conclusion. The application of the modified Ames test protocol for mutagenicity assessment of TGAIs from the classes of sulfonylureas and triazolpyrimidines under supplementation of the top agar with isoleucine is a more objective way to evaluate their mutagenicity. The proposed protocol expands the possibilities of revealing dangerous mutagenic impurities that may occur in TGAIs in the small quantities, and after entering the environment can cause the gain in the mutation level in living organisms.

Contribution

Contribution: Egorova O.V. — the concept and design of the study, the collection and processing of material, writing the text; Ilyushina N.A. — statistical processing of the material, text editing. All authors are responsible for the integrity of all parts of the manuscript and approval of the manuscript final version. 

Conflict of interest

Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest. 

Acknowledgement

Acknowledgement. The study had no sponsorship. 

Received

Received: June 21, 2022 / Accepted: October 3, 2022 / Published: November 30, 2022 

тест Эймсамутагенностьсульфонилмочевинытриазолпиримидиныthe Ames testmutagenicitysulfonylureastriazolo pyrimidinesReferencesNishimoto R. Global trends in the crop protection industry. J. Pestic. Sci. 2019; 44(3): 141-7. https://doi.org/10.1584/jpestics.D19-101Nishimoto R. Global trends in the crop protection industry. J. Pestic. Sci. 2019; 44(3): 141–7. https://doi.org/10.1584/jpestics.D19-101Илюшина Н.А. Оценка эквивалентности технических продуктов пестицидов-аналогов оригинальным действующим веществам по критерию «мутагенность». Экологическая генетика. 2019; 17(2): 101-12. https://doi.org/10.17816/ecogen172101-112Ilyushina N.A. Assessment of the equivalence of technical materials of analogous pesticides to original active substances on the basis of “mutagenicity” criterion. Ekologicheskaya genetika. 2019; 17(2): 101–12. https://doi.org/10.17816/ecogen172101-112 (in Russian)FAO/WHO. Manual on development and use of FAO and WHO specifications for pesticides. Geneva: WHO Press; 2016. Available at: https://apps.who.int/iris/bitstream/handle/10665/246192/WHO-HTM-NTD-WHOPES-2016.4-eng.pdf?sequence=1FAO/WHO. Manual on development and use of FAO and WHO specifications for pesticides. Geneva: WHO Press; 2016. Available at: https://apps.who.int/iris/bitstream/handle/10665/246192/WHO-HTM-NTD-WHOPES-2016.4-eng.pdf?sequence=1Hamel A., Roy M., Proudlock R. The bacterial reverse mutation test. Chapter 4. In: Proudlock R., ed. Genetic Toxicology Testing. A Laboratory Manual. Academic Press; 2016: 79-138.Hamel A., Roy M., Proudlock R. The bacterial reverse mutation test. Chapter 4. In: Proudlock R., ed. Genetic Toxicology Testing. A Laboratory Manual. Academic Press; 2016: 79–138.OECD. Test №471. Bacterial reverse mutation test. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4: Health Effects. Paris: OECD Publishing; 2020. https://doi.org/10.1787/9789264071247-enOECD. Test №471. Bacterial reverse mutation test. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4: Health Effects. Paris: OECD Publishing; 2020. https://doi.org/10.1787/9789264071247-enГОСТ 32376-2013. Методы испытания по воздействию химической продукции на организм человека. Метод оценки обратных мутаций на бактериях. М.; 2013GOST 32376-2013. Testing methods for the effects of chemical products on the human body. Method of evaluation of reverse mutations in bacteria. Moscow; 2013. (in Russian)Friederich U., Molko F., Hofmann V., Scossa D., Hann D., Würgler F.E., et al. Limitations of the Salmonella/mammalian microsome assay (Ames test) to determine occupational exposure to cytostatic drugs. Eur. J. Cancer Clin. Oncol. 1986; 22(5): 567-75. https://doi.org/10.1016/0277-5379(86)90045-3Friederich U., Molko F., Hofmann V., Scossa D., Hann D., Würgler F.E., et al. Limitations of the Salmonella/mammalian microsome assay (Ames test) to determine occupational exposure to cytostatic drugs. Eur. J. Cancer Clin. Oncol. 1986; 22(5): 567–75. https://doi.org/10.1016/0277-5379(86)90045-3Levy D.D., Hakura A., Elespuru R.K., Escobar P.A., Kato M., Lott J., et al. Demonstrating laboratory proficiency in bacterial mutagenicity assays for regulatory submission. Mutat. Res. Genet. Toxicol. Environ. Mutagen. 2018; 848: 403075. https://doi.org/10.1016/j.mrgentox.2019.07.005Levy D.D., Hakura A., Elespuru R.K., Escobar P.A., Kato M., Lott J., et al. Demonstrating laboratory proficiency in bacterial mutagenicity assays for regulatory submission. Mutat. Res. Genet. Toxicol. Environ. Mutagen. 2018; 848: 403075. https://doi.org/10.1016/j.mrgentox.2019.07.005Ilyushina N.A., Egorova O.V., Rakitskii V.N. Limitations of pesticide genotoxicity testing using the bacterial in vitro method. Toxicol. In Vitro. 2019; 57: 110-6. https://doi.org/10.1016/j.tiv.2019.02.018Ilyushina N.A., Egorova O.V., Rakitskii V.N. Limitations of pesticide genotoxicity testing using the bacterial in vitro method. Toxicol. In Vitro. 2019; 57: 110–6. https://doi.org/10.1016/j.tiv.2019.02.018Методические указания МУ-1.2.3364-16. Оценка мутагенной активности пестицидов. М.; 2016.Methodological guidelines MU-1.2.3364–16. Evaluation of the mutagenic activity of pesticides. Moscow; 2016. (in Russian)Руководство Р 1.2.3156-13. Оценка токсичности и опасности химических веществ и их смесей для здоровья человека. М.; 2014.Manual R 1.2.3156–13. Assessment of the toxicity and danger of chemicals and their mixtures for human health. Moscow; 2014. (in Russian)Егорова О.В., Демидова Ю.В., Илюшина Н.А. Оценка экспериментальных условий, влияющих на уровень спонтанных мутаций штаммов Salmonella, используемых в тесте Эймса. Гигиена и санитария. 2021; 100(7): 736-43. https://doi.org/10.47470/0016-9900-2021-100-7-736-743Egorova O.V., Demidova Yu.V., Ilyushina N.A. Assessment of experimental conditions affecting spontaneous mutation level of Salmonella strains used in the Ames test. Gigiena i Sanitaria (Hygiene and Sanitation, Russian journal). 2021; 100(7): 736–43. https://doi.org/10.47470/0016-9900-2021-100-7-736-743 (in Russian)Egorova O.V., Ilyushina N.A., Rakitskii V.N. Mutagenicity evaluation of pesticide analogs using standard and 6-well miniaturized bacterial reverse mutation tests. Toxicol. In Vitro. 2020; 69: 105006. https://doi.org/10.1016/j.tiv.2020.105006Egorova O.V., Ilyushina N.A., Rakitskii V.N. Mutagenicity evaluation of pesticide analogs using standard and 6-well miniaturized bacterial reverse mutation tests. Toxicol. In Vitro. 2020; 69: 105006. https://doi.org/10.1016/j.tiv.2020.105006Kenyon M.O., Cheung J.R., Dobo K.L., Ku W.W. An evaluation of the sensitivity of the Ames assay to discern low-level mutagenic impurities. Regul. Toxicol. Pharmacol. 2007; 48(1): 75-86. https://doi.org/10.1016/j.yrtph.2007.01.006Kenyon M.O., Cheung J.R., Dobo K.L., Ku W.W. An evaluation of the sensitivity of the Ames assay to discern low-level mutagenic impurities. Regul. Toxicol. Pharmacol. 2007; 48(1): 75–86. https://doi.org/10.1016/j.yrtph.2007.01.006Gedi V., Yoon M.Y. Bacterial acetohydroxyacid synthase and its inhibitors - a summary of their structure, biological activity and current status. FEBS J. 2012; 279(6): 946-63. https://doi.org/10.1111/j.1742-4658.2012.08505.xGedi V., Yoon M.Y. Bacterial acetohydroxyacid synthase and its inhibitors-a summary of their structure, biological activity and current status. FEBS J. 2012; 279(6): 946–63. https://doi.org/10.1111/j.1742-4658.2012.08505.xDuggleby R.G., Pang S.S. Acetohydroxyacid synthase. J. Biochem. Molecul. Biol. 2000; 33(1): 1-36.Duggleby R.G., Pang S.S. Acetohydroxyacid synthase. J. Biochem. Molecul. Biol. 2000; 33(1): 1–36.LaRossa R.A., Van Dyk T.K., Smulski D.R. Toxic accumulation of alpha-ketobutyrate caused by inhibition of the branched-chain amino acid biosynthetic enzyme acetolactate synthase in Salmonella typhimurium. J. Bacteriol. 1987; 169(4): 1372-8. https://doi.org/10.1128/jb.169.4.1372-1378.1987LaRossa R.A., Van Dyk T.K., Smulski D.R. Toxic accumulation of alpha-ketobutyrate caused by inhibition of the branched-chain amino acid biosynthetic enzyme acetolactate synthase in Salmonella typhimurium. J. Bacteriol. 1987; 169(4): 1372–8. https://doi.org/10.1128/jb.169.4.1372-1378.1987

The authors declare that there are no conflicts of interest present.