Введение

Дети, проживающие в зонах воздействия объектов металлургического комплекса и энергетической отрасли, испытывают негативное влияние выбросов, в том числе содержащих никель. У этих детей возрастает риск развития болезней, в патогенезе которых важным звеном является хроническое аллергическое воспаление в тканях и, возможно, реализация IgE-обусловленной сенсибилизации к низкомолекулярным химическим соединениям (НМХС). Манифестация сенсибилизации к никелю предполагает в последующем возникновение рецидива аллергических реакций даже при незначительном (следовом) поступлении этого вещества в организм. В зависимости от частоты и времени воздействия никеля интенсивность аллергического процесса может значительно варьировать. К сожалению, полного купирования гиперчувствительности к никелю практически не происходит [1].

Установлено, что воздействие никеля является причиной никель-ассоциированных аллергических патологий [1, 2]. Имеются данные, подтверждающие гемато-, иммуно-, нейро-, цито-, гено-, нефро- и гепатотоксические свойства никеля [3, 4], доказано его влияние на эндокринную систему. Так, в системе in vivo показано, что никель может увеличивать массу надпочечников, изменять механизмы регуляции гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой оси и нарушать секрецию гормонов [5]. Установлено влияние никеля на регуляцию электролитного состава крови, уровень стресса и физическую активность. Результаты исследований показали, что в условиях хронической гиперкортизолемии формируется дисбаланс между звеньями клеточного и гуморального иммунитета, нарушаются врождённые и адаптивные иммунные реакции, возникает перенапряжение регуляторных механизмов [5]. Устойчивость организма к НМХС обеспечивает система детоксикации. Дисбаланс в системе обезвреживания ксенобиотиков формируется за счёт генетического полиморфизма генов ферментов 1-й и 2-й фаз детоксикации, что является одним из факторов риска аллергической гиперчувствительности [6].

Очевидно, никель, поступающий в окружающую среду в результате производственной деятельности, повышает риск развития нарушений здоровья и в первую очередь аллергии, причём дети в силу возрастной морфофункциональной незрелости иммунной системы, а также особенностей гормонального статуса и детоксикационной способности наиболее чувствительны к средовым химическим факторам с аллергенным потенциалом.

Цель работы – изучить особенности иммунного и генетического статуса детей, проживающих в условиях аэрогенной экспозиции никелем.

Материалы и методы

Для научного обоснования показателей, отражающих особенности адаптационных возможностей детского организма в условиях биоэкспозиции никелем, выполнены медико-биологические исследования, соответствующие стандартам комитета по биомедицинской этике ФБУН «ФНЦ МПТ УРЗН» и требованиям Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации 2000 г. (ред. 2013 г.). На территории наблюдения размещены предприятия металлургического комплекса и энергетики, отмечено превышение среднегодовой концентрации (ПДКс.г.) никеля до 1,28 ПДКс.г. Среднегодовые концентрации никеля в атмосферном воздухе на условно чистой территории не превышали гигиенических нормативов (0,00005 мг/м³) [7]. Выполнен расчёт суточной дозы поступления никеля в организм при хронической аэрогенной экспозиции согласно P 2.1.10.3968–23.

В исследовании приняли участие практически здоровые дети дошкольного возраста (n = 89), посещающие детские дошкольные учреждения и проживающие на территориях с различным содержанием никеля в атмосферном воздухе. Группа наблюдения – дети, проживающие на территории с превышением гигиенического норматива среднегодовой концентрации никеля: n = 44 [мальчики – 12 (27,3%), девочки – 32 (72,7%)]. Группа сравнения – дети, проживающие вне зоны загрязнения атмосферного воздуха никелем: n = 45 [мальчики – 23 (51,1%), девочки – 22 (48,9%)]. Критерии включения в исследование: возраст от 4 до 6 лет; отсутствие указаний о приёме лекарственных препаратов, обладающих иммунотропным действием, в последние 6 мес. Критерии исключения: на момент обследования диагностированы острые инфекционные болезни; участие в другом исследовании. Все участники и их законные представители дали информированное добровольное письменное согласие на участие в исследовании, ознакомились с протоколом.

Химический анализ крови для количественного определения никеля выполнен методом масс-спектрометрии с индуктивно связанной плазмой в соответствии с МУК 4.1.3230–14 на приборе Agilent 7500сх (СШA). Исследование специфических IgЕ-антител к никелю проведено посредством аллергосорбентного тестирования с ферментной меткой, IgE общего и кортизола – методом иммуноферментного анализа на анализаторе ELx808IU (BioTek, СШA), IgG – методом однократной радиальной иммунодиффузии по Манчини. Методом проточной цитометрии выполнена количественная оценка уровня CD3+CD4+, CD4+CD25+CD127+ (Treg) (Becton Dickinson, СШA).

Для анализа частоты распределения полиморфных маркёров (аллелей, генотипов) в генах CPOX A/C (rs1131857), CYP1A1 Ile462Val (rs1048943), GSTP1 Ile105Val (rs1695), TP53 Arg72Pro (rs1042522) использован метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени с последующим анализом кривых плавления продуктов амплификации на приборе BioRAD CFX96 (Singapore). Сравнение частот встречаемости генотипов для выявления ассоциации с риском развития сенсибилизации выполняли с использованием критерия χ², тест на соответствие распределения генотипов равновесию Харди – Вайнберга проводили с использованием точного критерия (HWE-критерий), для описания полиморфизмов генов использованы N-число, процент; для аллель- и генотип-ассоциированных моделей – отношение шансов (OR) и 95%-й доверительный интервал (95% CI). Увеличение вероятности развития нарушений, ассоциированных с областью ответственности гена в организме, при наличии дикой или вариантной (мутантной) аллели оценивалось с использованием критерия RR (относительный риск) и 95%-го доверительного интервала (95% CI). Анализ данных генетических исследований проводился с помощью программы «ГенЭксперт». Статистический анализ данных проведён с помощью пакета Statistica 6.0 (StatSoft, СШA). Тип распределения данных в сформированных выборках определяли по критерию Колмогорова – Смирнова. Данные с нормальным распределением представлены в виде среднего арифметического значения (М) и стандартной ошибки среднего (m). Для оценки статистически значимых различий изучаемых выборок использовали двухвыборочный критерий Стьюдента. Проверка нулевых гипотез об отсутствии различий между выборочными данными и референтными значениями выполнена с помощью Т-критерия Вилкоксона. Значимость различий между долями оценивали по критерию χ². Номинальные переменные представлены в виде относительных частот (%). Выполнен расчёт относительного риска (RR) и 95%-го доверительного интервала для RR (95% CI). Для прогнозирования вероятности нарушения механизмов иммунорегуляции использовали простой логистический регрессионный анализ. Статистически значимыми считались различия, удовлетворявшие требованию p < 0,05.

Результаты

По результатам проведённых исследований установлено, что на территории наблюдения суточная доза никеля, рассчитанная по среднегодовым показателям, составила 0,00207 мг/кг в день, на территории сравнения – 0,000191 мг/кг в день. Результаты оценки содержания никеля в крови всех детей продемонстрировали статистически значимое (р = 0,043) превышение в 1,73 раза уровня никеля в биосредах детей группы наблюдения относительно значений, обнаруженных у обследуемых группы сравнения, и в 2,56 раза – верхней границы фонового уровня (р < 0,05) (табл. 1). Обнаружено, что максимальное содержание никеля в крови детей, проживающих на территории, где среднегодовые концентрации никеля превышали гигиенические нормативы, составило 0,0068 мкг/дм³, а у детей, проживающих на условно чистой территории, – 0,00187 мкг/дм³.

Результаты сравнительной оценки показателей иммунограммы у детей группы наблюдения продемонстрировали статистически значимое (р = 0,038–0,048) увеличение процентного и абсолютного содержания CD4+CD25+CD127+-лимфоцитов, регулирующих силу и продолжительность иммунного ответа, на 50% и повышение числа CD3+CD4+-лимфоцитов, важнейших клеток адаптивного ответа, обеспечивающих координацию иммунного реагирования, на 10% относительно значений группы сравнения. У детей с повышенным уровнем контаминации крови никелем среднегрупповое значение количества Treg выходит за верхнюю границу референтного диапазона. Обнаружено, что у детей, проживающих в условиях экспозиции никелем, среднегрупповое содержание стресс-гормона (кортизола) статистически значимо (р = 0,049) в 1,7 раза выше аналогичного показателя у детей, проживающих на условно чистой территории. Сопоставление результатов специфической сенсибилизации продемонстрировало, что у детей группы наблюдения достоверно на 30% превышена концентрация антител класса Е к никелю по сравнению с результатами, полученными у детей группы сравнения, и на 50% относительно верхней границы референтного диапазона (р < 0,05). Концентрация антител класса G в обеих группах определена в пределах регистровых значений, одновременно наблюдается превышение среднегруппового уровня IgE общего по отношению к верхней границе референтного интервала (р < 0,05).

Выявлено, что у детей с избыточным содержанием никеля в крови доля проб с превышениями референтных значений IgЕ, специфического к никелю, IgЕ общего, IgG и кортизола в 2,4; 2,7; 4,3 и 4,6 раза соответственно выше показателей в группе сравнения (р < 0,05) (табл. 2).

Установлена вероятностная причинно-следственная связь между содержанием никеля в крови и повышением абсолютного числа CD3+CD4+-лимфоцитов и титра IgG (b0 = –3,09, b1 = 137,29, R² = 0,10, F = 11,42, р = 0,002 и b0 = –3,01, b1 = 181,39, R² = 0,3, F = 43,16, р < 0,001 соответственно). Показано, что у обследуемых детей группы наблюдения в условиях повышенного содержания никеля в крови в 2,4–4,6 раза увеличивается относительный риск продукции IgЕ, специфического к никелю, IgЕ общего, IgG и кортизола (RR = 2,42; RR = 2,39; RR = 4,26 и RR = 4,6 соответственно), что позволяет отнести биоэкспозицию никелем к факторам дополнительной сенсибилизации и дезадаптации иммунной системы.

Группа наблюдения характеризуется достоверным повышением: частоты вариантной аллели С (OR = 2,24; 95% CI 1,01–4,97; RR = 1,76, 95% CI 1,53–2,01; p < 0,05) и гетерозиготного генотипа AC (OR = 3,38; 95% CI 1,24–9,24; p < 0,05) гена копропорфириногеноксидазы CPOX A/C rs1131857 в 2 и 2,5 раза соответственно; частоты вариантной аллели G (OR = 6,92; 95% CI 1,5–31,89; RR = 1,96; 95% CI 1,79–2,12; p < 0,05) и гетерозиготного генотипа AG (OR = 6,29; 95% CI 1,29–30,57; p < 0,05) гена первой фазы детоксикации цитохрома Р450 CYP1A1 Ile462Val в 6,1 и 5,1 раза соответственно; частоты вариантной аллели G (OR = 3,14; 95% CI 1,62–6,1; RR = 1,61; 95% CI 1,31–1,97; p < 0,05) и гомозиготного генотипа GG (OR = 5,5; 95% CI 1,12–27,08; p < 0,05) гена второй фазы детоксикации гутатионтрансферазы GSTP1 Ile105Val в 2,2 и 4,6 раза соответственно; частоты вариантной аллели G (OR = 6,58; 95% CI 3,42–12,68; RR = 1,39; 95% CI 1,05–2,02; p < 0,05) и гомозиготного генотипа GG (OR = 7,92; 95% CI 2,79–22,46; p < 0,05) гена онкосупрессора транскрипционного фактора TP53 Arg72Pro в 2,4 и 4,1 раза соответственно, что увеличивает вероятность наступления нежелательных сценариев, ассоциированных с компетентностью кандидатных генов, в 1,4–2 раза (табл. 3).

Обсуждение

Сочетание генетических полиморфизмов кандидатных генов и особенностей компартментов иммунной системы во многом определяет ответ детского организма на воздействие факторов риска, в том числе соединений никеля [8, 9]. Необходимо учитывать незрелость и критические периоды формирования иммунной системы у детей, а также возраст-ассоциированные особенности гормонального фона [8, 10]. Никель – один из триггеров развития и обострения аллергии. Связываясь в крови с альбумином или никельсодержащим белком никелоплазмином, он формирует инверсию иммунного ответа [11]. Кортизол выполняет ключевую роль в регуляции практически всех физиологических процессов в организме [10]. Образование гормон-рецепторного комплекса обусловливает транскрипцию различных генов или трансрепрессию факторов транскрипции, регулирующих гомеостаз, активность лимфоцитов, клеточное деление, апоптоз и др. [12]. Некоторые исследователи говорят о прямой связи между повышенной концентрацией кортизола и тяжестью аллергического процесса [13], однако другие учёные не установили корреляционной связи «кортизол – интенсивность аллергической реакции» [14]. Показано, что глюкокортикоиды в низких дозах оказывают иммуностимулирующий эффект, в высоких – иммунодепрессивное действие. Кортизол, будучи первичным мессенджером, инициирует ответную реакцию иммунокомпетентной клетки. Полагают, что в условиях длительного перепроизводства кортизола у Treg может снижаться иммуносупрессивный потенциал [15–17]. Продолжительная гиперкортизолемия является значимым фактором иммунной дисрегуляции, повышая риск развития иммуноопосредованных патологий в дальнейшем [18, 19]. Результаты настоящего исследования позволяют полагать, что повышение кортизола в крови является маркёром напряжённости адаптивного иммунного ответа в условиях избыточной биоэкспозиции никелем.

Доказана способность регуляторных клеток Treg либо формировать иммунологическую толерантность организма, либо обусловливать обострение болезни при воздействии проаллергических факторов (гаптенов) на фоне развития воспалительного процесса [19, 20]. При аллергии Treg не только демонстрируют количественные и качественные изменения, но и проявляют высокую пластичность. Обнаружено, что численность Treg зависит от присутствия аллергена в организме [21, 22]. Имеются сведения об увеличении у пациентов с аллергопатологией количества Treg и корреляции их содержания с тяжестью болезни [18, 23]. Рекрутирование регуляторных Т-клеток при сенсибилизации организма изучена недостаточно. Результаты настоящего исследования в значительной степени согласуются с данными литературы о наличии у Treg, обладающих фенотипической гетерогенностью и пластичностью, иммунорегуляторной активности, позволяя предполагать, что повышение численности данной популяции клеток является адаптационным процессом при экспозиции никелем.

Аэрогенное воздействие никеля реализует реагиновый тип повреждения тканей, а содержание специфического к никелю IgE характеризует уровень ингаляционной экспозиции и биоэкспозиции никелем [24]. Следует отметить у детей более высокий риск развития сенсибилизации, детерминированный особенностями возрастной функциональной активности иммунной системы [8]. Обнаружено, что у детей с аллергопатологией титр антител к иммуноглобулину E превышает значения у взрослых, при этом уровень аллерген-специфического IgE ассоциирован с тяжестью аллергического процесса и особенностями чувствительности к конкретному аллергену [8]. Результаты исследований и выводы, представленные в настоящей работе, корреспондируются с опубликованными в научной литературе данными, демонстрирующими напряжённость специфического гуморального иммунного ответа у детей в условиях экспозиции НМХС. Таким образом, подтверждается гиперпродукция специфических иммуноглобулинов при избытке никеля в биосредах.

Вариативность иммунного ответа человека обусловлена наследственными факторами и факторами окружающей среды [21]. Продемонстрировано, что однонуклеотидные полиморфизмы генов детоксикации 1-й фазы (цитохрома р 450) и 2-й фазы глутатион-S-трансфераз (GSTP1, GSTM1, GSTT1), гена копропорфириногеноксидазы (CPOX) в результате нокаута их функциональных генотипов теряют способность контролировать метаболизм и элиминацию металлов в организме, в результате чего экзогенные химические факторы среды обитания (соединения никеля) получают возможность негативно реализовать свой токсический потенциал (аллергия, канцерогенез) [25, 26]. Результаты настоящего исследования, которые описывают полиморфизмы генов детоксикации и апоптоза (CYP1A1, GSTP1, TP53, CPOX), ассоциированные с биоэкспозицией никелем, согласуются с данными, полученными другими авторами.

Заключение

Таким образом, сочетание избыточной экспозиции химическими факторами среды обитания (на примере аэрогенной экспозиции никелем) и генетических особенностей в виде точечных дефектов ДНК (на примере SNP генов детоксикации 1-й и 2-й фаз) приводит к стрессовым реакциям и неспособности организма к поддержанию баланса между иммунологической толерантностью и иммунной аутоагрессией, что особенно выражено у детей из-за возрастной наивности иммуноцитов.

В результате проведённых исследований установлено, что условия аэрогенной экспозиции никелем (1,28 ПДКс.г.) и полиморфизма кандидатных генов детоксикации и апоптоза (CYP1A1, GSTP1, TP53, CPOX) приводят к риску (RR = 1,39–1,96) формирования избыточной биоэкспозиции никелем (в 2,6 раза), напряжённости компартментов иммунного статуса (повышение численности субпопуляциии Т-лимфоцитов с супрессивной и хелперной активностью, гиперпродукция IgЕ, специфического к никелю, до 4,3 раза, p < 0,05) и адаптационных процессов (избыток кортизола в 4,6 раза; p < 0,05) [27]. Выявленные отличия от группы сравнения соответствуют аллергическому фенотипу и позволяют рекомендовать верифицированные показатели в качестве маркёров эффекта и чувствительности для задач профилактики развития аллергопатологии у детей, проживающих в условиях дестабилизации среды обитания (на примере соединений никеля).