Введение

Стресс определяется как состояние организма, при котором гомеодинамическое равновесие оказывается под угрозой [1, 2]. Это происходит из-за субъективного восприятия широкого спектра реальных или предполагаемых проблем, которые являются стрессорами [3, 4]. Для уравновешивания и поддержания наиболее гармоничного гомеодинамического состояния в организме существует высокоразвитая система стресса, которая служит саморегуляции и адаптации организма путём перенаправления энергии в соответствии с текущими потребностями [5]. Когда стрессоры превышают определённую степень тяжести или временной порог, запускается так называемая стрессовая реакция (борьба, бегство или замирание), состоящая из острых, последовательных, нормально адаптивных и ограниченных по времени компенсаторных реакций на разных уровнях эффекторных тканей. Это формирует хорошо организованный ответ как в центральной, так и в периферической нервной системе [6, 7].

Воздействие химических веществ потенциально способно вызывать различные неблагоприятные последствия для здоровья в зависимости от условий внешней и внутренней среды. Оксидативный стресс может усиливать реакции на психоэмоциональные нагрузки, что приводит к ухудшению адаптации организма к стрессовым условиям [8, 9]. Комплексные исследования воздействия химических веществ дают возможность выявить взаимодействие химических веществ и других факторов стресса, которое можно подтвердить с помощью токсикологических методов [10].

Крысы являются стандартной моделью для изучения поведения, в том числе уровня тревожности, депрессии и когнитивных функций, благодаря их генетической однородности и хорошо изученной нейробиологии. В частности, при исследовании влияния парацетамола в условиях стресса важно оценивать поведенческие изменения, так как стресс может значительно модифицировать реакцию организма на фармакологические агенты [11–13].

Таким образом, цель исследования – оценить влияние сочетанного воздействия химического фактора и хронического стресса на поведенческие реакции крыс в условиях субхронического эксперимента.

Материалы и методы

Исследование проведено на 48 белых аутбредных крысах с массой тела 190–210 г. Экспериментальных животных содержали в помещениях вивария со стандартными условиями, одинаковыми для всех групп животных. При уходе за животными, питании и проведении экспериментов руководствовались базисными нормативными документами: ГОСТ 33215–2014 «Руководство по содержанию и уходу за лабораторными животными. Правила оборудования помещений и организации процедур», рекомендациями Комитета по экспериментальной работе с использованием животных при Минздраве России, рекомендациями ВОЗ, рекомендациями Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других целей. Условия проведения и вывода животных из эксперимента соответствовали международным принципам Хельсинкской декларации о гуманном отношении к животным. Животные выводились из эксперимента путём эвтаназии с помощью углекислого газа с последующей декапитацией и вскрытием.

Перед началом исследования животных методом случайной выборки разделили на четыре экспериментальные группы по 6 самцов и 6 самок в каждой (табл. 1).

Моделирование состояния хронического стресса у крыс из групп стресса и сочетанного воздействия проводили согласно Matisz и соавт. [14]. Ежедневно на животных данных групп воздействовали стрессорами в соответствии с графиком (табл. 2).

Животным из групп «Парацетамол» и «Сочетанное воздействие» один раз в сутки в рабочие дни внутрижелудочно с помощью зонда вводили водный раствор парацетамола – 1000 мг/кг массы тела (100 мг/см³). Согласно литературным данным, парацетамол гепатотоксичен для крыс в дозах до 1500 мг/кг м. т. Животным из контрольной и стрессированной групп один раз в сутки в рабочие дни внутрижелудочно с помощью зонда вводили эквивалентный объём дистиллированной воды без примесей. Поведенческие показатели активности животных всех групп оценивали один раз в неделю с помощью тестов «Приподнятый крестообразный лабиринт», «Вынужденное исследование открытого поля», «Двигательная активность», «Норковый тест». Одно животное в день проходило не более одного теста. Все тесты проводили в первой половине дня.

Норковый тест проводили с помощью доски 40 × 40 см с 16 отверстиями (UgoBasil, Италия). Оценивали количество опусканий мордочки в отверстия (количество заглядываний в «норки»). Тест проводился в течение пяти минут. Вертикальную и горизонтальную двигательную активность определяли с помощью многофункциональной клетки для оценки общей активности (UgoBasil, Италия). Время теста – 10 мин. Для оценки тревожности применяли установку приподнятый крестообразный лабиринт (UgoBasil, Италия) с длиной рукавов 110 см и высотой бортов 40 см. Результаты фиксировались с помощью видеокамеры и системы видеотрекинга ANY-maze (Sloelting and Co., США). Определяли время нахождения в лабиринте, дистанцию, количество заходов, количество эпизодов замирания, время замирания в центре, закрытых и открытых рукавах. Время теста – 5 мин. Тест «Вынужденное исследование открытого поля» проводили с помощью квадратной установки (UgoBasil, Италия) со сторонами 95 см и высотой бортов 40 см. Результаты фиксировались с помощью видеокамеры и системы видеотрекинга ANY-maze (Sloelting and Co., США). Время теста – 5 мин.

Ткани гиппокампа для гистологического исследования фиксировали в 10%-м нейтральном формалине на фосфатном буфере и подвергали стандартной процедуре гистологической проводки для заливки в парафин. Срезы толщиной 5–7 мкм, сделанные на микротоме Leica, окрашивали гематоксилином и эозином. Микроскопическое исследование выполняли с помощью имиджинговой системы Celena X (окуляр ×10, объектив ×20).

Статистический анализ в рамках данного исследования был выполнен с использованием теста Вилкоксона для выявления изменений в значениях показателей. Проверка на нормальность распределения показателей проводилась с помощью теста Шапиро – Уилка, различия между группами выявляли с использованием дисперсионного анализа или теста Краскела – Уоллиса. Расчёты проводили с использованием пакетов pandas, numpy, matplotlib, seaborn и scipy на языке программирования Python версии 3.11, использована среда Visual Studio Code. Для учёта множественных сравнений и контроля уровня ошибок первого рода была использована поправка Холма – Бонферрони.

Результаты

Результаты «норкового теста» показывают, что крысы из контрольной группы чаще остальных заглядывают в «норки» (рис. 1; p = 0,001). При анализе показателя за каждую неделю подтверждаются значимые различия между группами, они сохранялись и при разделении выборки по признаку пола. При проведении теста Вилкоксона не наблюдалось изменений со временем в количестве заглядываний в «норки». Таким образом, мы видим, что воздействие как химического, так и нервно-психического стрессоров снижает исследовательскую активность крыс.

При изучении общей горизонтальной двигательной активности не были выявлены изменения в группах. Анализ общей вертикальной активности показал значимое повышение на второй неделе у стрессированных крыс. Также были установлены значимые различия вертикальной активности между группами крыс на 1-й неделе эксперимента (рис. 2; p = 0,004), на более поздних сроках эксперимента различия не были значимыми. Уменьшение вертикальной активности наблюдается в группе с сочетанным воздействием парацетамола и стресса, различия сохранялись на протяжении всего эксперимента, однако значимы были только на 1-й неделе. При сравнении показателей активности каждой группы между разными повторами эксперимента значимые различия обнаружены только между активностью на первой и второй неделе у крыс, подвергавшихся стрессу без химического воздействия. При разделении выборки по признаку пола аналогичные значимые различия были показаны между группами самцов, но не самок.

Анализ поведения крыс в тесте «Вынужденное исследование открытого поля» показал, что группы не различались по средней дистанции, пройдённой в тесте. В контрольной группе на первой неделе эксперимента выявлены эпизоды замирания на более короткое время по сравнению с остальными группами (p = 0.032). Крысы, получавшие парацетамол, за первую неделю прошли значимо меньшую общую дистанцию (p = 0,001). Самцы значимо реже пересекали периферию на 1-й неделе эксперимента (p = 0,001) и реже исследовали центральную зону начиная со второй недели (p = 0,027). На 1-й неделе самки реже пересекали центр и периферию по сравнению с остальными группами (p < 0,001). Всё это говорит о снижении двигательной активности из-за интоксикации парацетамолом. Крысы стрессированной группы значимо чаще исследовали центральную (p = 0,001) и субпериферическую (p = 0,007) зоны открытого поля и проводили там значимо больше времени (p = 0,002 и 0,046 соответственно), что может свидетельствовать о повышенной тревожности животных в данной группе. Животные группы сочетанного воздействия имели повышенный уровень тревожности, вместе с тем интоксикация парацетамолом вызывала снижение двигательной активности, поэтому группа отличалась от других опытных групп, однако не было заметных отличий от контрольной группы. На 2–4-й неделях группы не различались по времени, проведённому в центре, что, вероятно, говорит об адаптации животных к хроническому стрессу. При этом группы самок были более сходны между собой, нежели группы самцов.

При анализе результатов теста «Приподнятый крестообразный лабиринт» установлено, что в контрольной группе крысы проводили в открытых рукавах значительное время наравне с группой стресса, что позволяет говорить о повышенной исследовательской активности. При проведении повторных тестов увеличилось число заходов в открытые рукава. В стрессовой группе наблюдалось увеличение числа эпизодов замирания и времени замирания в повторных тестах, статистически значимые различия показаны на 3-й и 4-й неделях (р < 0,05). У самцов наблюдали такие же тенденции. Самки из групп «Парацетамол» и «Сочетанное воздействие» значимо дольше находились в закрытых рукавах лабиринта к концу эксперимента (р = 0,003), также значимо реже наблюдались эпизоды замирания по сравнению с самками других изученных групп (р = 0,01 на 3-й неделе и р = 0,106 на 4-й неделе). На 2-й неделе исследовательская активность животных резко повысилась, что может говорить об адаптации организма к токсиканту, после чего произошёл спад, и к 4-й неделе крысы явно предпочитали закрытые рукава лабиринта. По числу и длительности замираний наблюдалось уменьшение числа замираний к 4-й неделе с максимумом на 2-й неделе, тенденции были одинаковы для замирания как в центре, так и в рукавах. У самцов и самок наблюдаются сходные изменения поведения. В группе сочетанного воздействия на 4-й неделе крысы значимо реже посещали открытые рукава лабиринта (р = 0,005). При анализе изменчивости поведения установлено, что животные значимо изменили своё поведение на 2-й неделе эксперимента и стали значимо чаще исследовать центр лабиринта (р = 0,004). В группе «Парацетамол» значимо увеличилось число заходов в закрытые рукава лабиринта (р < 0,05 по результатам парного теста Вилкоксона), но крысы проводили там заметно больше времени (результаты статистически незначимы) и проходили по ним несколько большее расстояние (р = 0,012 и 0,001 для 2-й и 3-й недель соответственно, для 4-й недели результаты незначимы). По числу и длительности эпизодов замираний не удалось выявить устойчивой однонаправленной тенденции. У животных этой группы наблюдались более частые и длительные эпизоды замирания по сравнению с крысами других групп на 2-й и 4-й неделях эксперимента, реже – на 1-й и 3-й неделях (р < 0,05 во всех случаях). При разделении групп по полу общие тенденции были такие же, но различия достигли уровня статистической значимости только на 3-й неделе у самцов и на 3-й и 4-й неделях у самок. В целом в группе сочетанного воздействия наблюдались признаки повышенной тревожности, однако они слабо проявлялись в показателях поведенческих реакций, предположительно, вследствие интоксикации парацетамолом. Изменения, характерные для интоксикации (повышенная частота и длительность эпизодов пребывания в закрытых рукавах), были одинаково характерны как для группы «Парацетамол», так и для группы «Сочетанное воздействие».

Результаты гистоморфологического исследования гиппокампа крыс при внутрижелудочном введении парацетамола на фоне хронического стресса. Визуальный осмотр, проведённый на этапе препарирования головного мозга крыс, показал типичную для крыс анатомическую форму и размеры. Оболочки мозга прозрачные, без признаков воспаления или кровоизлияний. Сосуды мозговых оболочек не расширены, кровенаполнение умеренное. Большие полушария симметричны, поверхность гладкая, извилины и борозды чётко выражены. Мозжечок имеет типичную долевую структуру, поверхность его извилин гладкая. Ствол мозга цилиндрической формы, без очаговых изменений. Сосуды основания мозга не изменены. При макроскопическом исследовании головного мозга крыс, подвергавшихся воздействию исследуемых факторов и их сочетаний, не выявлено визуально определяемых патологических изменений.

На гистологическом срезе гиппокампа крыс контрольной группы (рис. 3, а, см. на вклейке) наблюдается чёткая организация клеточных структур. Нейроны располагаются упорядоченно, клетки имеют округлую форму с видимыми ядрами, равномерно распределёнными по ткани. В базальной части слоя видны плотные скопления нейронов, тогда как более высокие слои содержат преимущественно менее плотные клеточные структуры. Межклеточное пространство чистое, без признаков отёка или воспалительных инфильтратов, что свидетельствует об отсутствии патологических изменений и подтверждает нормальное состояние клеток. На гистологическом срезе гиппокампа крыс, подвергшихся воздействию стресса (рис. 3, б, см. на вклейке), также отсутствуют структурные изменения. Нейроны не выглядят менее плотными, дезорганизации клеточных рядов не наблюдается.

На гистологическом срезе гиппокампа крыс, подвергшихся воздействию парацетамола (рис. 4, а, см. на вклейке), видна чёткая организация клеточных структур. Нейроны располагаются упорядоченно, клетки имеют округлую форму с видимыми ядрами, равномерно распределёнными по ткани. В базальной части слоя присутствуют плотные скопления нейронов, тогда как более высокие слои содержат преимущественно менее плотные клеточные структуры. Межклеточное пространство чистое, без признаков отёка или воспалительных инфильтратов, что свидетельствует об отсутствии патологических изменений и подтверждает нормальное состояние клеток гиппокампа.

На гистологическом срезе гиппокампа крыс, подвергшихся сочетанному воздействию (рис. 4, б, см. на вклейке), наблюдается чёткая организация клеточных структур. Нейроны располагаются упорядоченно, клетки имеют округлую форму с видимыми ядрами, равномерно распределёнными по ткани. В базальной части слоя видны плотные скопления нейронов, тогда как более высокие слои содержат преимущественно менее плотные клеточные структуры. Межклеточное пространство чистое, без признаков отёка или воспалительных инфильтратов, что свидетельствует об отсутствии патологических изменений и подтверждает нормальное состояние клеток гиппокампа в контрольной группе.

Обсуждение

Результаты проведённых исследований указывают на влияние парацетамола в сочетании с хроническим стрессом на поведенческие реакции животных. У самцов сочетанное воздействие токсиканта и стресса снижает двигательную активность, особенно в сравнении с группами, получавшими только стрессовое воздействие. У самок наблюдались менее выраженные различия, что может быть объяснено гормональными особенностями.

В исследованиях, ранее проведённых нашей группой, не было выявлено влияния сочетанного воздействия на поведенческие реакции («Норковый тест» и клетка общей активности), но обнаружено влияние на гематологические показатели крыс [15]. Также было показано влияние на поведенческие реакции сочетанного воздействия хронического стресса и сорбиновой кислоты [16] или акриламида [17].

В текущей же работе выявлены значимые различия в поведенческих реакциях как в «Норковом тесте», так и при определении общей активности, а также обнаружены некоторые различия в тестах «Вынужденное исследование открытого поля» и «Приподнятый крестообразный лабиринт». В группе, подвергавшейся стрессовому воздействию, заметна повышенная двигательная активность животных, что может свидетельствовать как о более активном исследовательском поведении, так и о повышенной тревожности животных. В группе, получавшей парацетамол, выявлено снижение двигательной активности (маркёра исследовательского поведения), что, вероятно, объясняется сильным токсическим воздействием. В группе сочетанного воздействия обнаружены признаки повышенной тревожности, однако присутствуют также изменения поведенческих реакций, которые можно объяснить интоксикацией, ослабляющей проявление тревожных черт в поведенческих реакциях. Отметим, что гистологическое исследование не выявило патологических изменений в тканях мозга. Таким образом, проведённые на данном этапе исследования тесты не позволили выявить значительного влияния сочетанного воздействия парацетамола на поведенческие реакции животных. Наблюдаемые изменения можно объяснить раздельным влиянием нервно-психического и химического стресса.

Ограничения исследования. Стоит подчеркнуть, что исследование проводилось только на одном виде животных, также была использована только одна, хотя и достаточно высокая, концентрация токсиканта. Относительно небольшое количество животных в исследуемых группах ограничивает мощность статистических тестов.

Заключение

В группе сочетанного воздействия у крыс обнаружены признаки повышенной тревожности, модифицированные токсическим действием парацетамола: двигательная активность была выражена по сравнению с группой, получавшей только парацетамол, что позволяет говорить о повышенной тревожности, вызванной стрессовыми воздействиями. Тем не менее она была ниже, чем в группе, подверженной стрессу без токсического воздействия. Признаки сочетанного воздействия отсутствовали, все наблюдаемые проявления можно объяснить независимым разнонаправленным влиянием факторов на поведенческие реакции животных.