Введение

Хронический стресс относится к наиболее распространённым проблемам современного общества, оказывает значительное влияние на здоровье человека. В эволюционном аспекте воспалительные реакции и связанные с ними формы тревожного и избегательного поведения обеспечивали выживание, помогая организму справляться с инфекциями и иными угрозами. Однако в современных условиях при снижении влияния патогенов и возрастании уровня психосоциального стресса эти же механизмы могут приводить к дисфункции: чрезмерная активация воспалительных путей способствует развитию тревожных расстройств [1]. Парацетамол, несмотря на свою популярность и относительную безопасность, способен влиять на нейроиммунные механизмы. Парацетамол может усиливать окислительный стресс и нарушать баланс между провоспалительными и противовоспалительными процессами в мозге [2]. В условиях хронического стресса, когда уже активированы воспалительные и стрессовые пути, дополнительное воздействие парацетамола может усугублять снижение экспрессии нейропротекторных факторов и антиоксидантных ферментов.

Окислительный стресс уже более 20 лет рассматривается как ключевой фактор, связанный с гибелью нейронов при различных нейродегенеративных болезнях [3, 4]. Современные модели in vitro и in vivo, имитирующие человеческую патологию, позволяют глубже изучать взаимосвязь окислительного стресса с другими клеточными механизмами, формирующими комплексный патогенез нейродегенеративных состояний [5, 6].

Гиппокамп является одной из наиболее чувствительных к воздействию глюкокортикоидов и стрессовых факторов областей мозга у млекопитающих, в том числе у грызунов и человека. При длительном повышении уровня глюкокортикоидов или хроническом стрессе в гиппокампе происходят многочисленные морфологические и молекулярные изменения: нарушения нейрогенеза, глиоза, уменьшение сложности дендритов и снижение плотности синаптических шпилек и др. [7, 8]. Кроме того, имеются данные о повреждающем действии парацетамола на ткань гиппокампа [9].

Ген Hmox1 кодирует гемоксигеназу, участвующую в детоксикации гема и модуляции окислительного стресса [10]. Для гена Sod1 патогенез связан с его функцией кодирования супероксиддисмутазы-1 – фермента, детоксицирующего супероксидные радикалы как токсичные продукты окислительного метаболизма. В условиях стресса и токсического воздействия веществ, таких как парацетамол, снижение экспрессии Sod1 усугубляет оксидативный стресс, что способствует повреждению нейронов [11]. Ген Bdnf отвечает за синтез нейротрофического фактора мозга. Этот фактор поддерживает выживание нейронов, нейрогенез и синаптическую пластичность, а его угнетение при воздействии парацетамола и стресса снижает способность мозга к адаптации и восстановлению, что отражается в когнитивных и эмоциональных нарушениях [12]. Повышение транскрипционной активности гена нейротрофина может указывать на антистрессовое воздействие, например, при приёме антидепрессантов [13]. Экспрессия гена Bdnf начинается на ранней стадии развития и сохраняется на протяжении всей взрослой жизни [14].

Согласно научным данным, у человека приём парацетамола в дозе 150–200 мг/кг массы тела может привести к развитию интоксикации, тогда как у крыс гепатотоксические эффекты вызываются значительно более высокими дозами – до 1500 мг/кг массы тела [15]. При этом малые дозы парацетамола (50–100 мг/кг массы тела) могут оказывать антидепрессивное действие [16]. Парацетамол известен своей генотоксичностью, наблюдаемой в гепатоцитах [17], имеются данные о негативном воздействии на центральную нервную систему [18]. Кроме того, долгосрочное пренатальное воздействие парацетамола ассоциируется с изменениями метилирования ДНК у детей с диагнозом «синдром дефицита внимания и гиперактивности» (СДВГ), что свидетельствует о возможном эпигенетическом влиянии препарата [19].

Таким образом, хронический стресс и токсическое воздействие парацетамола в сочетании могут оказывать значительное влияние на нейрохимические и молекулярные процессы в мозге, в том числе на экспрессию ключевых генов, отвечающих за антиоксидантную защиту и нейротрофическую поддержку, – Sod1, Hmox1 и Bdnf. Несмотря на накопленные знания, механизмы взаимодействия парацетамола и хронического стресса на уровне регуляции этих генов остаются недостаточно изученными.

Цель исследования – оценить влияние хронического непредсказуемого стресса и перорального введения парацетамола, а также их сочетанного воздействия на морфологическое состояние головного мозга и на экспрессию генов антиоксидантной системы и нейротрофического фактора в гиппокампе крыс.

Материалы и методы

Моделирование хронического стресса было проведено в соответствии с протоколом [20]. Использовали следующие стрессоры:

В течение 28-дневного эксперимента ежедневно применяли не более двух стрессоров. Порядок выбора стрессоров формировался по заранее составленному плану, обеспечивающему ротацию всех факторов с минимизацией повторов одного и того же стрессора или изменением его продолжительности в последовательные дни. Такой подход позволял поддерживать постоянный уровень стрессовой нагрузки и предотвращать адаптацию к однотипным стрессорам.

Перед началом стрессовой экспозиции животные были адаптированы к помещению и оборудованию, в котором проводились стрессовые процедуры, путём ежедневного пребывания в экспериментальной комнате по 30 мин в течение 3 дней. Длительность адаптации была выбрана на основании общепринятых протоколов и подтверждена предварительными наблюдениями, свидетельствующими о стабилизации поведения и физиологических параметров животных [21, 22].

Для проведения эксперимента использовали парацетамол (ООО «Озон», Россия) в форме таблеток. В рамках фундаментального исследования, не предполагающего регистрационных требований, данные о партии и сроке годности препарата не фиксировали. Все процедуры хранения и применения соответствовали рекомендациям производителя. Парацетамол метаболизируется преимущественно в печени с образованием неактивных метаболитов; ≈ 90–95% принятой дозы выводится почками в течение 24 ч. Кумуляции препарата при соблюдении рекомендованных доз не происходит, что подтверждается стабильным периодом полувыведения (2–3 ч) [23]. Для обеспечения дополнительной безопасности и снижения риска передозировки была выбрана схема введения препарата в будни с перерывом на выходные.

В исследовании использовали 48 аутбредных белых крыс линии Wistar массой 180–220 г, приобретённых в ФГУП «Питомник лабораторных животных «Рапполово». Животные были распределены методом случайной выборки на четыре группы по 12 особей в каждой с учётом массы тела и пола (самцы и самки в равном соотношении). Группа отрицательного контроля (I) получала только чистую дистиллированную воду перорально, что обеспечивало соблюдение принципов контроля в эксперименте. Животных группы хронического стресса (II) подвергали регулярному воздействию стрессоров. В группе III животные ежедневно в будни получали только водный раствор парацетамола перорально в дозе 1000 мг/кг массы тела (100 мг/см³). В группе IV животных подвергали сочетанному воздействию стрессоров и парацетамола.

По окончании эксперимента подопытных выводили из него путём мгновенной декапитации. Для объективного и независимого анализа данных полученные образцы были закодированы сквозной нумерацией без уточнения групповой принадлежности.

Фрагмент головного мозга для морфологической оценки фиксировали в 10%-м формалине на фосфатном буфере, что позволяло сохранить структуру тканей для последующего анализа. После стандартной гистологической обработки и заливки в парафиновые блоки на микротоме Leica (Германия) получали срезы тканей толщиной 5–7 мкм. Микроскопический анализ окрашенных гематоксилином и эозином препаратов проводили с помощью системы визуализации Celena X (Южная Корея) с использованием объектива 20× и окуляра 10×.

Для генетического анализа из фрагмента гиппокампа, предварительно обработанного лизирующим раствором (тризол или ExtractRNA) и замороженного в жидком азоте, РНК выделяли с помощью коммерческого набора ExtractRNA фирмы Evrogen (Москва, Россия) в соответствии с протоколом производителя. Для оценки экспрессии генов Hmox, Sod и Bdnf методом ПЦР в реальном времени были подобраны пары праймеров (1 мМ) и оптимизированы условия их работы (температура отжига плюс 59 °C, продолжительность 45 с, 39 циклов). Для приготовления реакционной смеси объёмом 12,5 мкл использовали 8,82 мкл деионизированной воды, 1,3 мкл 10-кратного буфера, по 0,8 мкл праймеров, 0,5 мкл dNTP (0,2 мМ), 0,1 мкл SybrGreen, 0,2 мкл ДМСО, 0,18 мкл Taq-полимеразы и по 2,5 мкл кДНК образца (100 нг). В качестве референтного гена для стандартизации результатов использовали ген Gapdh. Оценку полученных результатов проводили с использованием метода 2^(-ΔΔCt) [24].

В процессе статистической обработки данных применён метод бутстрэппинга (Bootstrap), который позволил оценить структурные характеристики выборки путём многократной генерации подвыборок с помощью метода Монте-Карло. Анализ проводили в среде Jupyter Notebook с использованием языка программирования Python версии 3.11. В результате были рассчитаны средние значения и стандартные отклонения для каждой группы, что позволило оценить вариативность данных. Для корректировки уровней статистической значимости (p-adj) использован метод Холма – Бонферрони, что позволило контролировать множественные сравнения и избежать ложноположительных результатов. При p < 0,05 результаты признавали статистически значимыми и использовали для выводов о статистических различиях между группами.

Всех экспериментальных животных содержали в стандартных условиях вивария при постоянной температуре плюс 25 °C, относительной влажности воздуха 30–0% и 12-часовом световом режиме (освещение с 08:00 до 20:00). Кормление и поение осуществлялось ad libitum. При проведении исследований строго соблюдали требования действующих нормативных документов: ГОСТ 33215–2014 «Руководство по содержанию и уходу за лабораторными животными. Правила оборудования помещений и организации процедур»; рекомендации Комитета по экспериментальной работе с использованием животных при Минздраве России; рекомендации Всемирной организации здравоохранения; положения Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых в экспериментальных и иных научных целях; международные принципы Хельсинкской декларации о гуманном обращении с животными; требования «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу Минздрава СССР от 12.08.1977 г. № 755).

Результаты

Макроскопическое исследование головного мозга крыс показало, что все исследуемые фрагменты органа сохранили типичную анатомическую форму и размеры. Большие полушария были симметричными, с чётко выраженными извилинами и бороздами, гладкой поверхностью. Мозжечок имел выраженную долевую структуру с ровной поверхностью извилин, а ствол мозга – цилиндрическую форму без очаговых изменений. Оболочки головного мозга были прозрачными, без признаков воспаления или кровоизлияний. Сосуды основания головного мозга и оболочек не были расширены, имели умеренное кровенаполнение.

У животных контрольной группы гиппокамп, расположенный в глубине височной доли, имел серо-жёлтый цвет, изогнутую форму и ровную поверхность при средней длине 10 мм. На гистологических срезах гиппокампа крыс отчётливо прослеживалась упорядоченная архитектура клеточных слоёв, нейроны были аккуратно выстроены, их тела имели округлую форму с чётко различимыми ядрами, равномерно распределёнными по тканевой структуре (рис. 1, а, см. на вклейке). В базальных слоях наблюдали плотные скопления нейронных клеток, тогда как в более поверхностных зонах преобладали менее компактные клеточные образования. Межклеточное пространство было чистым и не содержало признаков отёка или воспалительных инфильтратов, что свидетельствовало о сохранении нормального гистологического состояния гиппокампа у крыс контрольной группы и отсутствии патологических изменений.

На фрагментах гиппокампа, изъятых у животных из групп II, III и IV, не выявлено значимых структурных изменений под воздействием стресса или парацетамола по сравнению с контрольной группой (рис. 1, б–г, см. на вклейке). Нейроны сохраняли упорядоченную организацию, имели округлую форму с хорошо различимыми и равномерно распределёнными ядрами. Организация нейронов по зонам гиппокампа была сохранена. Межклеточное пространство свидетельствовало об отсутствии патологических изменений и подтверждало нормальное состояние клеток гиппокампа в исследуемых группах. Морфологическая целостность ткани не была нарушена.

В ходе исследования провели статистический анализ экспрессии генов антиоксидантной системы в образцах гиппокампа крыс всех исследуемых групп. При статистическом анализе кратности экспрессии гена Hmox у самцов и самок в гиппокампе получены следующие результаты (рис. 2).

Наиболее низкое значение исследуемого параметра наблюдали в группе III как у самцов, так и у самок. Причём для самцов данное различие является статистически значимым по сравнению с группой I (p = 0,001) и II (p = 0,011). В группах самок статистически значимых различий в экспрессии данного гена обнаружено не было (p > 0,05).

При оценке активности гена Sod1 в гиппокампе у самцов и самок обнаружены статистически значимые различия (рис. 3).

Уровень экспрессии данного гена у самцов и у самок в группах I и II был выше, чем в группах III и IV. Уровни экспрессии гена Sod1 в группе, получавшей только парацетамол, достигли –5,37 у самцов и –3,73 у самок, что значительно ниже контроля (–0,26 у самцов и +0,26 у самок; p = 0,001). В группе с сочетанным воздействием парацетамола и стрессоров уровни экспрессии составили –4,84 у самцов и –4,37 у самок, также значительно отличаясь от контроля (p = 0,001). В группе II экспрессия исследуемого гена была значительно выше (–0,32 у самцов и –0,52 у самок), чем в группах с парацетамолом (p = 0,001). Таким образом, парацетамол как при одиночном воздействии, так и в сочетании с хроническим стрессом вызывал более выраженное снижение экспрессии Sod1, чем только стресс и отсутствие воздействий.

Анализ транскрипционной активности гена Bdnf в гиппокампе животных из исследуемых групп показал сходную с экспрессией гена Sod1 картину (рис. 4).

В группах животных, получавших парацетамол и сочетанное воздействие парацетамола с хроническим стрессом, наблюдали значительное снижение экспрессии гена Bdnf по сравнению с группой контроля и группой, подверженной воздействию стресса. Кратность экспрессии Bdnf в группе III составили в среднем –5,39 у самцов и –5,74 у самок, значительно уступая контролю (0,49 у самцов и 0,4 у самок; p = 0,001). В группе IV уровни экспрессии были также снижены (–4,68 у самцов и –7,19 у самок) по сравнению с контролем (p = 0,001). Кроме того, экспрессия Bdnf в группе III была значительно ниже, чем в группе II (0,21 у самцов и 0,08 у самок; p = 0,001), а в группе IV уровень Bdnf также был существенно ниже, чем при воздействии только стресса (p = 0,001).

Обсуждение

Отсутствие визуальных различий и сохранение нормального состояния ткани гиппокампа у животных всех исследуемых групп может указывать на недостаточно тяжёлые или длительные повреждающие факторы для развития морфологических изменений.

Экспрессия гена Hmox1 исследуется при изучении депрессивных состояний у людей [25]. Индукция Hmox1 и его продуктов защищает от болезней системы кровообращения, в том числе от ишемических повреждений, которые могут проявляться и при стрессовых воздействиях [26].

По результатам описанного нами исследования у самцов крыс при сочетанном воздействии парацетамола и стресса наблюдали значительное снижение Hmox1, что может указывать на нарушение защитных механизмов, тогда как у самок таких изменений не выявлено. Это свидетельствует о различиях между полами в регуляции и адаптации к стрессу и токсинам. Информация о различиях уровня белка, экспрессируемого данным геном, у самцов и самок упоминается в работе Ofosu-Boateng M. [27]. Кроме того, патогенез, связанный с Hmox1, может быть, вероятно, менее прямолинейным и зависеть от дополнительных факторов.

Поведение генов Sod1 и Bdnf характеризуется значительным снижением экспрессии под воздействием парацетамола отдельно, а также в сочетании с хроническим стрессом, что может быть связано с их ключевой ролью в защите нейронов от окислительного стресса и поддержании нейропластичности. Угнетение этих генов указывает на ослабление антиоксидантных и нейротрофических механизмов, что ведёт к повышенной уязвимости клеток мозга к повреждениям и нарушению когнитивных функций.

Снижение экспрессии гена Sod1 под воздействием парацетамола и хронического стресса приводит к ослаблению антиоксидантной защиты нейронов. Поскольку фермент, закодированный данным геном, катализирует преобразование супероксидных радикалов в менее токсичные молекулы, его угнетение способствует накоплению реактивных форм кислорода, что вызывает повреждение клеточных структур и нейрональную дисфункцию.

В проведённых ранее исследованиях оценивали токсическое воздействие этанола на кратность экспрессии данного гена у крыс: уже после трёх суток воздействия токсиканта наблюдали тенденцию к снижению транскрипционной активности Sod1 в печени [28]. Воздействие же тетрахлорметана после 72 ч приводило к статистически значимому снижению транскрипционной активности данного гена [29]. Воздействие парацетамола не оказало выраженного влияния на кратность экспрессии гена Sod1 в печени крыс [30].

Угнетение Bdnf снижает нейротрофическую поддержку, необходимую для поддержания синаптической пластичности и нейрогенеза. Это ведёт к ухудшению когнитивных функций и снижению адаптивных возможностей мозга в условиях стресса и токсического воздействия парацетамола. Совместное воздействие парацетамола и хронического стресса усиливает негативное влияние на экспрессию этих генов, что может объяснять более выраженные когнитивные и эмоциональные нарушения, наблюдаемые в экспериментальных моделях.

Тем не менее воздействие стрессоров в чистом виде не повлияло на уровень экспрессии гена нейротрофина в гиппокампе животных. Это может объясняться недостаточно тяжёлыми или длительными повреждающими факторами [31]. Кроме того, имеет место индивидуальная уязвимость к стрессу в регуляции Bdnf [32].

Хронический стресс способен усиливать последствия окислительного стресса и изменять метаболизм ксенобиотиков, в том числе парацетамола [33], что может приводить к повышению его генотоксических и транскрипционных эффектов [34]. Токсическая нагрузка в свою очередь может усиливать воздействие стрессовых факторов и вызывать непредсказуемые последствия для экспрессии генов и состояния клеток мозга, увеличивая повреждение нейронов и нарушая работу антиоксидантных систем.

Проведённое исследование позволило оценить влияние хронического стресса и перорального введения парацетамола, а также их сочетанного воздействия на морфологическое состояние гиппокампа и экспрессию ключевых генов антиоксидантной системы и нейротрофического фактора у крыс.

1. Морфологический анализ показал отсутствие визуально определяемых патологических изменений в гиппокампе и других отделах мозга у животных всех исследуемых групп, что свидетельствует о сохранении структурной целостности ткани при выбранных условиях воздействия.

2. В группе самцов, подвергшихся сочетанному воздействию парацетамола и хронического стресса, выявлено достоверное снижение экспрессии гена Hmox1 в гиппокампе по сравнению с контролем и группой стресса, что может свидетельствовать о нарушении защитных механизмов антиоксидантной системы. У самок подобных изменений не обнаружено, что указывает на половые различия.

3. Гены Sod1 и Bdnf, играющие роль в защите нейронов от окислительного стресса и обеспечении синаптической пластичности, демонстрируют сходную динамику: значительное снижение экспрессии при воздействии парацетамола как изолированно, так и в сочетании со стрессом. Это указывает на ослабление нейропротекторных механизмов и снижение адаптивного потенциала гиппокампа, следовательно, и на возможное развитие когнитивных и эмоциональных нарушений.

4. Отдельно воздействующие в проведённом эксперименте стрессоры сами по себе не вызывали значительных изменений ни в морфологической структуре гиппокампа и других отделов мозга, ни в экспрессии генов Hmox1, Sod1 и Bdnf. Тем не менее при сочетанном воздействии с парацетамолом наблюдался синергетический эффект, проявляющийся в нарушении регуляции генов, ответственных за антиоксидантную защиту и нейропластичность. Таким образом, даже при отсутствии видимых структурных повреждений на молекулярном уровне происходят изменения, которые могут негативно сказаться на функции мозга и его способности к адаптации.

Результаты выполненного исследования расширяют представления о механизмах нейротоксичности парацетамола и его взаимодействии с хроническим стрессом. Для более полного понимания сочетанного воздействия химического и психоэмоционального факторов на организм необходимо продолжить работу с применением дополнительных методов, в том числе прямой оценки генотоксичности.