Введение

Наночастицы различной природы (металлы, оксиды металлов, углеродные наноструктуры и др.) рассматриваются как особый класс техногенных поллютантов, обладающих повышенной биологической активностью по сравнению с микрочастицами соответствующего химического состава [1]. Их малый размер, высокая удельная поверхность и способность к адсорбции токсикантов облегчают пересечение биологических барьеров, способствуют генерации активных форм кислорода и запуску каскадов оксидативного стресса, воспаления и апоптоза [2, 3]. Экспозиция наночастицами оксида свинца (НЧ PbO) рассматривается как один из наиболее опасных факторов техногенного загрязнения воздуха, особенно в районах свинцового производства и переработки металлов. Анализ воздуха рабочей зоны подтверждает, что свинец, будучи доминирующим компонентом наночастиц, встречается как в виде моноэлементных кластеров, так и в составе многокомпонентных частиц, что повышает их биологическую доступность [4].

Малый размер частиц и аэродинамические свойства НЧ PbO позволяют им проникать в дистальные отделы дыхательных путей, преодолевая гематоэнцефалический барьер, и накапливаться в различных структурах мозга [5]. Показано, что при ингаляционном и интраназальном поступлении свинцовые наночастицы детектируются вдоль обонятельного пути, в том числе в обонятельных луковицах, где формируются ультраструктурные повреждения аксонов и митохондрий нейронов [6].

Современные данные подтверждают, что центральная нервная система относится к ключевым мишеням хронического воздействия НЧ PbO даже при относительно низких концентрациях, моделирующих условия производственной среды. На молекулярно-генетическом уровне у крыс после субхронической и хронической ингаляционной экспозиции выявляются изменения экспрессии генов, связанных с митохондриальным апоптозом (P53, BAX, BCL-2) в обонятельных луковицах, гиппокампе и других отделах мозга. Увеличение отношения BAX/BCL-2 и сдвиги экспрессии P53 трактуются как активация митохондриально-опосредованной гибели клеток на фоне оксидативного стресса [7, 8].

Наряду с транскрипционными сдвигами электронно-микроскопические исследования демонстрируют возрастание доли патологически изменённых митохондрий в нейронах обонятельных луковиц после введения оксидных наночастиц металлов, в том числе PbO и Fe2O3, сопровождающееся нарушением целостности крист и признаками энергетической недостаточности [9]. При этом именно обонятельные структуры рассматриваются как входные ворота для наночастиц, обладающих способностью к аксональному транспорту и быстрому включению в нейрональные сети. Однако исследования преимущественно фокусируются либо на поведенческих и гистологических эффектах [10], либо на экспрессии отдельных генов [11], тогда как интегральная характеристика митохондриального профиля нейронов обонятельных луковиц при длительной ингаляции НЧ PbO остаётся недостаточно изученной. Заполнение этого пробела имеет принципиальное значение для понимания ранних нейротоксических механизмов свинцовых наночастиц и разработки биомаркёров риска профессиональных и экологически обусловленных нейродегенеративных изменений.

Цель исследования – изучить влияние наночастиц оксида свинца на митохондриальный профиль обонятельных луковиц крыс при хроническом ингаляционном воздействии.

Материалы и методы

Эксперимент на животных. Исследование проводилось на 40 половозрелых самках крыс линии Wistar, разделённых на четыре группы по десять особей в каждой. В опытных группах НЧ PbO подавались в экспозиционную башню для ингаляции в установке по типу «только нос» (CH Technologies, Westwood, NJ, США), где в специальных рестрейнерах опытная группа животных подвергалась воздействию НЧ PbO четыре часа в день пять раз в неделю в течение четырёх и восьми месяцев. Контрольные группы животных находились в аналогичной ингаляционной установке без генерации наночастиц.

Животных содержали в стандартных условиях специально оборудованного помещения вивария (температура плюс 22 ± 2 °C, цикл «свет – темнота» 12/12 ч) в соответствии с ГОСТ 33215–2014 «Руководство по содержанию и уходу за лабораторными животными» и International guiding principles for biomedical research involving animals, разработанными CIOMS и ICLAS (2012). Исследование одобрено локальным этическим комитетом ФБУН ЕМНЦ ПОЗРПП Роспотребнадзора (протокол № 4 от 12.07.2022 г.).

Характеристика НЧ. НЧ PbO генерировали с помощью электрического искрения в атмосфере азота из свинцового стержня 99,99%-й чистоты диаметром 5,6 мм. Поток полученных НЧ Pb, смешиваясь с воздухом, окислялся в НЧ PbO размером 18,2 ± 4,2 нм и подавался в экспозиционную башню в концентрации 0,215 мг/м³ (рис. 1).

Пробоподготовка и исследование биологических образцов. Для оценки митохондриального профиля нейронов обонятельных луковиц после воздействия НЧ PbO отбирали образцы исследуемой ткани размером ≈ 1 × 1 × 1 мм, затем фиксировали в 2,5%-м глутаральдегиде на 0,1 М какодилатном буфере pH 7,4. Постфиксация образцов включала отмывку буфером, дофиксацию OsO4, дегидратацию, проводку и полимеризацию. Из образцов приготавливали серию ультратонких срезов (70 нм) с использованием ультрамикротома Leica EM UC7 (Leica Microsystems, Австрия), после чего срезы помещали на медные сетки 200 mesh для электронной микроскопии и контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца. В завершение проводили напыление углеродной плёнки на поверхность среза с помощью устройства для напыления Leica EM ACE600 (Leica Microsystems, Австрия). Подробные протоколы вышеизложенных этапов описаны в МР 1.2.0307–2022*.

Визуализацию выполняли с использованием сканирующего электронного микроскопа (SEM) Hitaсhi REGULUS SU8220 в режиме BF-STEM. Съёмка производилась в диапазоне увеличений ×20 000–100 000. На срезе анализировали 20+ полей зрения. Если суммарное количество митохондрий на снимках было менее 100, делали дополнительные снимки для достижения минимального значения. Процедура рандомизации полей зрения и методика подготовки образцов для электронной микроскопии представлены на рис. 2.

Определение митохондриального профиля обонятельных луковиц. Оценка степени повреждения митохондрий включает в себя выделение пяти последовательных стадий трансформации внутренней мембраны по классификации Mei G. Sun и соавт. [12]. Перед началом морфотипирования митохондрий из полученных электронных микрофотогафий (ЭМФ) исследователи составили комплект репрезентативных ЭМФ митохондрий для дальнейшей сверки анализируемых изображений с референсами. Каждую митохондрию относили к одному из пяти морфотипов. При выполнении работ было ранжировано 13 823 митохондрии в 120 образцах обонятельных луковиц крыс контрольных и опытных групп (40 особей × 3 повторности). Для минимизации субъективности визуальной оценки при определении митохондриальных морфотипов анализ проводили два независимых исследователя. Затем каждый исследователь независимо подсчитывал долю (в %) митохондрий каждого из пяти морфотипов от общего числа в пробе. Дальнейшие расчёты проводили с использованием усреднённых данных при условии, что значение коэффициента корреляции между результатами исследователей было ≥ 0,4. Для каждого животного рассчитывали среднее значение процентного распределения морфотипов.

Расчёт индекса состояния митохондриального аппарата. Индекс состояния митохондриального аппарата (СМА) рассчитывали путём распределения типов митохондрий по формуле (1):

1a + 0,5b + 0,25с + 0,125d + 0e,                       (1)

где a – процентное соотношение в образце митохондрий нормального морфотипа; b – нормально-везикулярного; c – везикулярного; d – везикулярно-набухшего; e – набухшего.

Для последующего сравнения степени повреждения митохондрий в течение четырёх и восьми месяцев использовали относительный СМА, представляющий собой отношение индивидуальных значений к медиане в контрольной группе. Нормализация данных относительно контрольных групп позволила нивелировать физиологические возрастные различия в состоянии митохондриального матрикса.

Статистическая обработка данных. Первичные данные обрабатывали в Microsoft Excel. Статистический анализ проводили с использованием программного обеспечения Statistica 12.0 (StatSoft). Для оценки значимости различий применяли U-критерий Манна – Уитни, H-критерий Краскела – Уоллиса и критерий χ² Пирсона. Пороговый уровень статистической значимости – p ≤ 0,05.

Результаты

Морфологический анализ методом ЭМ показал, что в нейронах обонятельных луковиц животных всех групп присутствуют все пять разновидностей митохондрий (рис. 3).

Сравнение распределений представленных морфотипов показало отсутствие статистически значимых различий в группах четырёхмесячного воздействия НЧ PbO (χ² (4; 0,05) = 2,51; p = 0,64). При этом и в контрольной, и в опытной группах преобладали митохондрии везикулярного типа (рис. 4).

В то же время наблюдались различия в митохондриальном профиле при восьмимесячной экспозиции (χ² (4; 0,05) = 279,93; p < 0,01). Доля митохондрий везикулярного типа не изменилась, тогда как количество нормальных и нормально-везикулярных форм увеличилось на 3,71 и 12,14% соответственно, а везикулярно-набухших и набухших – снизилось на 12,70 и 1,94% соответственно относительно группы контроля (8 мес).

Статистический анализ выявил достоверные различия в ультраструктуре митохондрий между контрольными группами животных с четырёх- и восьмимесячной экспозицией (χ² (4; 0,05) = 205,75; p < 0,01). Так, при восьмимесячной экспозиции в экспонированной группе зафиксировано снижение доли митохондрий везикулярного типа на 19,5% относительно контроля. Одновременно наблюдалось увеличение доли везикулярно-набухших и набухших форм на 12,83 и 6,09% соответственно.

В связи с обнаружением значимых различий между данными контрольных групп перед проведением статистического анализа результатов экспонированных групп была выполнена нормализация данных относительно медианных значений индекса СМА контрольных групп. Полученные результаты морфотипирования были применены для расчёта индекса, характеризующего состояние митохондриального аппарата (рис. 5).

Обсуждение

Митохондрии нейронов – динамичные органеллы, подвергающиеся частому слиянию и делению. Митохондриальная динамика является ключевым свойством поддержания энергетического метаболизма и клеточного гомеостаза, обеспечивающим клетки АТФ и регулирующим важные функции, в том числе кальциевый гомеостаз и реакцию на стресс [13]. Сбалансированное чередование слияния и деления поддерживает целостность митохондриальной сети [14]. Нарушение же динамического равновесия митохондрий способно привести к их дисфункции и запуску ряда патологических процессов. Общее состояние нейрона во многом определяется состоянием его митохондриального пула; любые устойчивые изменения в нём могут негативно сказаться на клеточном гомеостазе [15]. Общие закономерности митохондриальной динамики проявляются и в перестройке митохондрий нейронов при физиологическом старении [16].

В данном исследовании статистический анализ подтвердил наличие достоверных различий в ультраструктуре митохондрий между контрольными группами с разной длительностью эксперимента, что соответствует общей картине возрастных нейродегенеративных изменений [17]. В экспериментальных группах обнаружена отчётливая разница между эффектами краткосрочного и длительного ингаляционного воздействия НЧ PbO на митохондрии нейронов обонятельных луковиц. По истечении четырёх месяцев экспозиции значимых различий не обнаружено, что, вероятно, связано с наличием компенсаторных механизмов или недостаточным для структурных нарушений накоплением дозы свинца. При увеличении продолжительности воздействия НЧ на нейроны обонятельных луковиц до восьми месяцев наблюдалось значимое повышение индекса СМА, что указывает на прогрессирующее влияние НЧ PbO на митохондриальный аппарат обонятельных луковиц головного мозга с увеличением длительности экспозиции.

Во-первых, это соответствует концепции накопительного эффекта: длительное пребывание наночастиц PbO в ткани мозга и их медленное выведение способствует постепенному нарастанию повреждений [18]. Во-вторых, ольфакторный путь, являющийся прямым и относительно быстрым маршрутом попадания наночастиц из полости носа в ЦНС с обходом гематоэнцефалического барьера, может занимать от нескольких минут до нескольких дней в зависимости от механизма транспорта НЧ [19]. Следует учитывать, что значительная часть ингаляционных НЧ может и не достигать головного мозга, оседая в слизистых оболочках [20]. Возможно, за восьмимесячный период происходит не просто линейное увеличение экспонированной дозы, но и изменение характера распределения: НЧ достигают более глубоких слоёв обонятельных луковиц или вовлекают дополнительные популяции клеток (например, микроглию).

Кроме того, вопреки предполагаемому снижению индекса СМА у группы животных, подвергавшихся экспозиции в течение восьми месяцев, в исследовании наблюдались противоположные результаты. Постоянное воздействие НЧ PbO способствует поддержанию хронического окислительного стресса, что ведёт к непрерывному образованию активных форм кислорода (АФК) и истощению антиоксидантных систем нейронов. Можно предположить, что на данном этапе компенсаторные механизмы представляют собой попытку сбалансировать количество апоптирующих и сливающихся митохондрий для поддержания их дыхательной функции. Гипотеза частично подтверждается ранее опубликованными данными об изменении экспрессии отдельных генов. В частности, отмечается повышение уровня экспрессии гена GSTP1, активирующегося в ответ на окислительный стресс. Параллельно снижается экспрессия генов P53 и BCL-2, а соотношение экспрессии генов BAX/BCL-2 увеличивается, что, вероятно, может быть связано с активацией апоптоза через митохондриальный путь [7].

Таким образом, хроническое воздействие наночастиц PbO в течение восьми месяцев сопровождается более выраженными изменениями митохондрий нейронов обонятельных луковиц головного мозга крыс, чем при воздействии в течение четырёх месяцев. Следовательно, необходимо учитывать временной фактор при оценке нейротоксичности наноматериалов на основе PbO.

Заключение

Сравнение митохондриального профиля нейронов обонятельных луковиц головного мозга восьмимесячной экспозиции показало, что:

Полученные данные свидетельствуют об активации компенсаторных механизмов, направленных на поддержание клеточного гомеостаза в условиях хронической интоксикации. Перспективы дальнейших исследований связаны с комплексным изучением молекулярных и биоэнергетических механизмов адаптации митохондрий, а также с количественной морфометрией их популяции в нейронах при хроническом воздействии наночастиц PbO. Такой подход позволит разработать более точные критерии оценки нейротоксичности наночастиц и меры профилактики их вредного воздействия на организм.

* МР 1.2.0307–2022 «Методические рекомендации по оценке цитотоксического действия наночастиц методом электронной микроскопии», 26.12.2022 г.