Введение

Бурное развитие нанотехнологий и активное внедрение наноматериалов в различные сферы медицины, биотехнологий и промышленности обусловили формирование нового междисциплинарного направления – нанотоксикологии [1, 2], основные задачи которой связаны с идентификацией специфических рисков, обусловленных взаимодействием наноразмерных объектов с биологическими системами. Ключевым постулатом нанотоксикологии является положение о том, что переход вещества в наноразмерное состояние принципиально изменяет его физико-химические характеристики (удельную поверхность, реакционную способность, способность к проникновению через биологические барьеры), что делает экстраполяцию данных о токсичности макроформ на наночастицы некорректной и потенциально опасной [3–5]. В связи с этим одним из приоритетных направлений становится комплексная оценка безопасности новых наноматериалов, особенно демонстрирующих значительные функциональные преимущества перед традиционными аналогами. В связи с этим особый интерес представляют наночастицы на основе гадолиния [6]. Соединения гадолиния в макроформе (например, хелаты Gd³+) нашли широкое применение в качестве парамагнитных контрастных агентов для магнитно-резонансной томографии (МРТ) [7]. Наночастицы могут вызывать более выраженное снижение тонуса скелетной мускулатуры, а также обладают способностью к нацеливанию на патологические очаги (опухоли и др.) за счёт эффекта повышенной проницаемости и удерживания (EPR-эффект) [8].

Несмотря на очевидные функциональные преимущества наночастиц гадолиния, их применение сопряжено с новыми, не до конца изученными рисками. Высокая реакционная способность наноповерхности, потенциальная возможность внутриклеточного накопления, длительная биоперсистенция в органах ретикулоэндотелиальной системы, а также возможное высвобождение токсичных ионов Gd³+ в кислой среде лизосом требуют всестороннего анализа. В отличие от хорошо изученных низкомолекулярных хелатов [7] данные о хронической токсичности, биораспределении, иммуногенности и влиянии на ключевые клеточные процессы (апоптоз, аутофагия, оксидативный стресс) для наночастиц гадолиния единичны.

Таким образом, необходимость комплексного доклинического изучения наночастиц гадолиния – от характеристики их физико-химических свойств до глубокого понимания молекулярных механизмов взаимодействия с организмом – критически важное условие обеспечения качественной оценки безопасности и успешного перехода этих перспективных агентов в клиническую практику.

Материалы и методы

В качестве наностабилизирующей полимерной матрицы применялся природный полисахарид арабиногалактан, ранее уже использованный нами и нашими коллегами при оценке других металлических наночастиц [9]. Электронную микроскопию для определения распределения частиц по размерам выполняли на просвечивающем электронном микроскопе Leo 906 E (Zeiss, Германия), размеры металлокомплексных наночастиц составляли 1–72 нм, содержание гадолиния в образце – 8,5–11,5% [10], форма наночастиц и макромолекулы нанокомпозита – сферическая.

Экспериментальные исследования биологических эффектов нанокомпозита гадолиния (далее – GdАГ) проведены на 72 беспородных белых крысах-самцах массой тела 180–240 г. Были сформированы три группы животных по 24 особи в каждой. Раствор GdАГ вводили внутрижелудочно в течение 10 дней в дозе 500 мкг/кг (опытная группа GdАГ500) и в дозе 5000 мкг/кг (опытная группа GdАГ5000) по гадолинию. Особям контрольной группы внутрижелудочно вводили в аналогичном объёме (0,5 мл) NaCl 0,9%. Указанная минимальная доза в 500 мкг/кг была выбрана нами как пороговая доза в отношении эффекта, выходящего за пределы нормальных физиологических реакций у лабораторных животных (d. toxica minima) и подтверждена при исследовании других наночастиц в составе нанокомпозита (Ag, Bi, Se и т. д) [11]. Известно, что при пороговых дозах включаются компенсаторные механизмы (детоксикация, репарация), поэтому в качестве дозы сравнения нами была выбрана доза, превышающая пороговую в 10 раз (5000 мкг/кг).

На следующий день после окончания воздействия наночастиц 12 животных из каждой группы были выведены из эксперимента (ранний период исследования), остальные животные – через 6 мес (отдалённый период исследования).

Общий протокол пробоподготовки органов (почки, печень). После декапитации у каждого животного извлекали почки, печень и семенники, которые фиксировали в нейтральном буферном растворе формалина (10%), обезвоживали этанолом восходящей концентрации (от 70 до 100%) и помещали в гомогенизированную парафиновую среду для гистологических исследований HistoMix (BioVitrum, Россия). Далее приготовленные с помощью микротома МС-1 серийные фронтальные срезы органов (4–5 мкм) окрашивали на обычных гистологических предметных стёклах гематоксилином и эозином для обзорной микроскопии с разрешением ×100 и ×400.

Морфометрическое исследование проводили с помощью пакета прикладных программ Image Scope M. В образцах почек определяли толщину эндотелия проксимальных извитых канальцев и площадь капсулы Шумлянского – Боумена в корковом веществе органа, в печени оценивали балочно-радиальное строение печёночных долек, подсчитывали число звездчатых макрофагов Купфера в синусоидных капиллярах и число полиядерных гепатоцитов.

Определение концентрации гадолиния в органах методом масс-спектрометрии. Сразу после извлечения органы тщательно высушивали в сухожаровом шкафу при температуре плюс 70 °С в течение трёх суток, а затем измельчали. После взятия навески пробы минерализовали в концентрированной азотной кислоте. Минерализацию осуществляли в автоклавах под контролем температуры в микроволновой системе Milestone ETHOS с автоклавами ротора высокого давления SKISET при температуре плюс 190 °С.

Концентрацию определяли методом количественной масс-спектрометрии с индуктивно связанной плазмой на приборе Agilent 7500ce (Agilent Technologies, США) на базе лаборатории гидрохимии и химии атмосферы Лимнологического института СО РАН с использованием многоэлементного стандарта ICP-MS 68-A-A (High Purity Standards, США) и внутреннего стандарта индия. Данные представлены как концентрация металла в органах в каждой группе, выраженная в нг/г сухой органики.

Математико-статистические методы исследования. Статистический анализ результатов исследования проводили с использованием пакета прикладных программ SPSS Statistics 26 (IBM, США) применением W-критерия Шапиро – Уилка и U-критерия Манна – Уитни. Статистически значимые различия между группами подтверждались при достигнутом уровне значимости р ≤ 0,05.

Результаты

Гистологическое исследование печени в экспериментальных группах не выявило значительных отличий от образцов контрольной группы (рис. 1, см. на вклейке). Кровенаполнение синусоидальных капилляров, центральных вен и вен портальных трактов соответствовало норме. Портальные тракты не имели признаков расширения, склероза или воспаления. Структура печёночных долек, состоящая из балочно-радиальных элементов, осталась неизменной. Количество звездчатых макрофагов Купфера в синусоидальных капиллярах не отличалось от такового в контрольной группе. Количество полиядерных гепатоцитов не показало статистически значимых отличий от контрольной группы (табл. 1). В отдалённый постконтактный период также не было обнаружено каких-либо отличий от контрольной группы (см. табл. 1).

Кровоснабжение коркового и мозгового веществ почек было в пределах нормы, нарушения реологических свойств крови в органе отсутствовали. Состояние стенок почечных артерий и артериол также соответствовало норме. Интерстициальная ткань нарушений не имела. Структура почечных клубочков была сохранена. Очаги воспаления или некроза в корковом и мозговом веществе почечной ткани отсутствовали. Эпителий дистальных и проксимальных почечных канальцев не имел отклонений от нормы. В корковом веществе почки сразу после окончания воздействия в дозе 500 мкг/кг отмечается статистически значимое увеличение площади капсулы Шумлянского – Боумена по сравнению с контрольной группой (р = 0,0001), в отдалённом постконтактном периоде площадь камеры ещё больше увеличивается (табл. 2; рис. 2, см. на вклейке). Установлено, что при воздействии нанокомпозита гадолиния в дозе 5000 мкг/кг площадь камеры Шумлянского – Боумена снижается по сравнению с контрольными значениями (р = 0,01), однако в отдалённом постконтактном периоде данный показатель приходит в норму и не отличается от контрольных значений (см. табл. 2; см. рис. 2 на вклейке) Согласно Г.Г. Автандилову [12], показатели площади камеры Шумлянского – Боумена могут изменяться в пределах 30%. В нашем случае все изменения площади камеры укладываются в рамки физиологической нормы для данной структуры. Толщина эндотелия проксимальных извитых канальцев коркового вещества почки во всех группах животных не отличалась от показателей контрольной группы, в отдалённом постконтактном периоде данный показатель также не имел отличий от контрольных значений (табл. 3; см. рис. 2 на вклейке).

Результаты определения концентрации гадолиния во внутренних органах животных при различных дозах введения представлены в табл. 4.

Согласно результатам проведённых исследований, внутрижелудочное введение нанокомпозита гадолиния в дозах 500 и 5000 мкг/кг вызывает статистически значимое повышение концентрации металла в исследуемых органах, в том числе в более поздние сроки наблюдения. Зафиксированные изменения указывают на то, что гадолиний в форме нанокомпозита с арабиногалактаном демонстрирует значительную степень бионакопления в изученных органах.

Обсуждение

Редкоземельные металлы играют важную роль в современных технологиях, используются в лекарственных препаратах (лантан) и внутривенных контрастных веществах (гадолиний). Контрастные вещества на основе гадолиния представляют собой многодентатные органические лиганды, которые прочно связывают ион металла, в теории снижая его токсичность. Эти контрастные вещества выводятся преимущественно с мочой, однако их остаточных количеств достаточно для обнаружения концентраций гадолиния в органах (мозге, почках, печени и др.). К известным осложнениям введения контрастных веществ на основе гадолиния относятся повреждение почек, нефрогенный системный фиброз, кожные болезни и иногда необратимые неврологические последствия [13–15]. Так, ретроспективный анализ 68 пациентов с хронической болезнью почек показал, что у десяти пациентов (14,7%) повреждение почек развилось в течение 48 ч после эндоваскулярного введения содержащих гадолиний препаратов ProHance или Omniscan для установки почечного стента [16]. Обзор 19 клинических исследований показал, что острое повреждение почек после введения гадолиниевого контраста наблюдалось в 12–50% случаев [17]. Также выявлено, что контрастные вещества на основе гадолиния в дозах, используемых для ангиографии, более нефротоксичны, чем йодсодержащие [18]. Вышеуказанные факты неопровержимо свидетельствуют о токсичности гадолиний-содержащих препаратов, а также их опасности для здоровья и даже жизни пациентов. В связи с этим остро стоит вопрос о доступной и альтернативной замене гадолиний-содержащих препаратов, большие надежды связаны с использованием гадолиния в наноформе.

Важно отметить, что существует механизм образования наночастиц гадолиния из микрочастиц после внутривенного введения контрастного вещества для магнитно-резонансной томографии. Механизм подобной трансформации обусловлен выщелачиванием из фармацевтических лигандов и амальгамированием в шиповидные наночастицы [19]. На основании известных принципов токсичности наночастиц (чем больше отклонение частиц от сферической формы и больше удельный объём, тем токсичнее) можно сделать вывод о том, что шиповидные наночастицы, образующиеся из макрочастиц гадолиний-содержащих препаратов, также вносят вклад в развитие общей токсичности. В исследуемом нами композите частицы имели сферическую форму, что значительно снижало их токсичность. Это было подтверждено результатами эксперимента. Так, при воздействии нанокомпозита в дозе 500 мкг/кг отмечалось незначительное увеличение площади камеры Шумлянского – Боумена, а при воздействии в дозе 5000 мкг/кг – снижение данного показателя. Эти изменения не носили патологического характера и лежали в пределах физиологической нормы для данной структуры, однако имели разнонаправленный характер, что косвенно указывает на возможный дозозависимый эффект при действии нанокомпозита гадолиния на ткань почки. При этом структура остальных проксимальных и дистальных отделов нефрона (проксимальных и дистальных извитых канальцев) не имела изменений. Вместе с тем проведённое нами ранее in vitro исследование воздействия GdАГ на культуру клеток фибробластов 3T3-SV 40 выявило цитотоксический эффект начиная с концентрации 0,02 мМ (3,6 мкг/мл). Результаты показали, что GdАГ оказывает дозозависимое цитотоксическое действие на клетки [20]. Высокую адаптационную способность печени и почек в контексте гомеостаза целостного организма можно обосновать функциями этих органов, так как печень является органом детоксикации и постоянно взаимодействует с токсическими агентами, поступающими в организм. Почка обладает аналогичным свойством, поскольку напрямую выводит продукты метаболизма токсиканта.

Также важно отметить, что в печени и почках содержание гадолиния кратно увеличивалось, что согласуется с выводами других исследователей о способности гадолиния аккумулироваться в различных органах, в том числе в печени [21], и нарушать их нормальную работу. В нашем случае гистологический анализ печени белых крыс не выявил каких-либо видимых изменений в структуре органа. Следовательно, накопление наночастиц гадолиния в печени никак не сказалось на его нормальном функционировании. Возможно, это связано с высокими адаптивными свойствами данного органа, а также сферической формой наночастиц, снижающей их потенциальную токсичность.

Заключение

Таким образом, исследованные нами наночастицы гадолиния благодаря заданным физико-химическим характеристикам в отличие от макрочастиц и биотрансформируемых наночастиц шиповидной формы являются перспективными лечебно-диагностическими препаратами, значительно снижающими негативные эффекты для почек и печени. В дальнейшем это может быть использовано при создании диагностических препаратов нового поколения, спектр негативных эффектов для организма которых практически отсутствует, а также требует значительно меньшего количества вещества при проведении диагностики.