ПЦР-анализ присутствия вирулентных генов в изолятах E. coli из внешней среды в сравнении с изолятами из кала здоровых и больных воспалительными заболеваниями кишечника людей

Введение. Патогенные Escherichia coli являются значительной угрозой здоровью человека. Передача этого патогена осуществляется в том числе через объекты водной среды, окружающие человека.

Цель исследования — оценка наличия патогенных E. coli в поверхностных и сточных водах. Изоляты из скважин, сточных вод, вод бассейнов и поверхностных водных источников сравнивали с изолятами из кала здоровых людей и людей с воспалительными заболеваниями кишечника.

Материалы и методы. Для выявления генетических детерминант потенциальной вирулентности использовали метод ПЦР. Признаками патогенности были выбраны 19 вирулентных генетических детерминант: 11 токсинов, 5 адгезинов и инвазинов и 2 патогенных серотипа. ПЦР-детекцию генов антибиотикорезистентности карбапенемаз и детекцию патотипов E. coli проводили с помощью коммерческих наборов «Амплисенс» согласно протоколу производителя. Проанализировано 47 изолятов E. coli, выделенных из водных объектов окружающей среды (ВООС), 44 изолята из кала практически здоровых людей, 43 изолята из кала больных воспалительными заболеваниями кишечника (ВЗК).

Результаты. В целом выявлено сходство группы ВООС и группы, выделенной от здоровых людей. В этих группах выявили 2 типа патогенных детерминанант — токсины CNF1, CNF2 и инвазин einv. Значительно отличаются от этих групп изоляты группы ВЗК. Только в этой группе детектированы регулятор адгезии aggR, инвазивный плазмидный антиген ipaH, гемолизин hly и ген антибиотикоустойчивости NDM. Ген CNF1 выявлялся среди ВЗК достоверно чаще, чем в других группах. Единственный выявленный патотип E. coli, энтероаггрегационный, присутствовал исключительно среди изолятов этой группы.

Ограничения исследования. В рамках данного исследования не удалось сравнить между собой различные объекты внешней среды (поверхностные воды и сточные, объекты очистных сооружений и т. д.) по патогенному бактериальному потенциалу в силу недостаточной представленности каждого типа таких объектов в анализируемой выборке. Это будет предметом наших дальнейших исследований.

Заключение. Патогенный потенциал изолятов E. coli из водных источников близок к таковому у изолятов из кала здоровых людей.

Участие авторов:
Пай Г.В. — концепция и дизайн исследования, выполнение экспериментальной работы, статистическая обработка, написание текста, редактирование;
Ракитина Д.В. — выполнение экспериментальной работы, написание текста, редактирование;
Панькова М.Н. — сбор и обработка материала, выделение изолятов и посев культур;
Федец З.Е. — сбор и обработка материала, выделение изолятов и посев культур;
Мания Т.Р. — редактирование;
Загайнова А.В. — редактирование;
Юдин С.М. — редактирование.
Все соавторы — утверждение окончательного варианта статьи, ответственность за целостность всех частей статьи.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов в связи с публикацией данной статьи.

Финансирование. Исследование проведено в рамках НИР «Разработка технологий криоконсервации и архивирования биообразцов микроэкологических ресурсов человека (шифр «Криобанк»)», № АААА-А18-118020590091-2, НИР «Разработка унифицированных методов, включающих отбор проб, для осуществления определения микробиологического и паразитологического загрязнения сточных вод» (шифр «Сточные воды») № АААА-А21-121011190012-3.

Поступила: 01.03.2022 / Принята к печати: 12.04.2022 / Опубликована: 31.05.2022

1. Kaper J.B., Nataro J.P., Mobley H.L. Pathogenic Escherichia coli. Nat. Rev. Microbiol. 2004; 2(2): 123-40. https://doi.org/10.1038/nrmicro818

2. Mull B., Hill V.R. Recovery and detection of Escherichia coli O157:H7 in surface water, using ultrafiltration and real-time PCR. Appl. Environ. Microbiol. 2009; 75(11): 3593-7. https://doi.org/10.1128/AEM.02750-08

3. Chern E.C., Tsai Y.L., Olson B.H. Occurrence of genes associated with enterotoxigenic and enterohemorrhagic Escherichia coli in agricultural waste lagoons. Appl. Environ. Microbiol. 2004; 70(1): 356-62. https://doi.org/10.1128/aem.70.1.356-362.2004

4. Hamilton M.J., Hadi A.Z., Griffith J.F., Ishii S., Sadowsky M.J. Large scale analysis of virulence genes in Escherichia coli strains isolated from Avalon Bay, CA. Water Res. 2010; 44(18): 5463-73. https://doi.org/10.1016/j.watres.2010.06.058

5. Lauber C.L., Glatzer L., Sinsabaugh R.L. Prevalence of pathogenic Escherichia coli in recreational waters. J. Great Lakes Res. 2003; 29(2): 301-6. https://doi.org/10.1016/S0380-1330(03)70435-3

6. Sidhu J.P., Ahmed W., Hodgers L., Toze S. Occurrence of virulence genes associated with Diarrheagenic pathotypes in Escherichia coli isolates from surface water. Appl. Environ. Microbiol. 2013; 79(1): 328-35. https://doi.org/10.1128/AEM.02888-12

7. Reynolds C., Checkley S., Chui L., Otto S., Neumann N.F. Evaluating the risks associated with Shiga-toxin-producing Escherichia coli (STEC) in private well waters in Canada. Can. J. Microbiol. 2020; 66(5): 337-50. https://doi.org/10.1139/cjm-2019-0329

8. Fagerström A., Mölling P., Khan F.A., Sundqvist M., Jass J., Söderquist B.Comparative distribution of extended-spectrum beta-lactamase-producing Escherichia coli from urine infections and environmental waters. PLoS One. 2019; 14(11): e0224861. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0224861

9. Bleichenbacher S., Stevens M.J.A., Zurfluh K., Perreten V., Endimiani A., Stephan R., et al. Environmental dissemination of carbapenemase-producing Enterobacteriaceae in rivers in Switzerland. Environ. Pollut. 2020; 265(Pt. B): 115081. https://doi.org/10.1016/j.envpol.2020.115081

10. Jang J., Suh Y.S., Di D.Y.W., Unno T., Sadowsky M.J., Hur H.G. Pathogenic Escherichia coli strains producing extended-spectrum β-lactamases in the Yeongsan River basin of South Korea. Environ. Sci. Technol. 2013; 47(2): 1128-36. https://doi.org/10.1021/es303577u

11. Diab M., Hamze M., Bonnet R., Saras E., Madec J.Y., Haenni M. Extended-spectrum beta-lactamase (ESBL)- and carbapenemase-producing Enterobacteriaceae in water sources in Lebanon. Vet. Microbiol. 2018; 217: 97-103. https://doi.org/10.1016/j.vetmic.2018.03.007

12. Montero L., Irazabal J., Cardenas P., Graham J.P., Trueba G. Extended-spectrum beta-lactamase producing-Escherichia coli isolated from irrigation waters and produce in Ecuador. Front. Microbiol. 2021; 12: 709418. https://doi.org/10.3389/fmicb.2021.709418

13. Scotta C., Juan C., Cabot G., Oliver A., Lalucat J., Bennasar A., et al. Environmental microbiota represents a natural reservoir for dissemination of clinically relevant metallo-β-lactamases. Antimicrob. Agents Chemother. 2011; 55(11): 5376-9. https://doi.org/10.1128/aac.00716-11

14. Walsh T.R., Weeks J., Livermore D.M., Toleman M.A. Dissemination of NDM-1 positive bacteria in the New Delhi environment and its implications for human health: an environmental point prevalence study. Lancet Infect. Dis. 2011; 11(5): 355-62. https://doi.org/10.1016/s1473-3099(11)70059-7

15. Baquero F., Martınez J.L., Canton R. Antibiotics and antibiotic resistance in water environments. Curr. Opin. Biotechnol. 2008; 19(3): 260-5. https://doi.org/10.1016/j.copbio.2008.05.006

16. Winfield M.D., Groisman E.A. Role of nonhost environments in the lifestyles of Salmonella and Escherichia coli. Appl. Environ. Microbiol. 2003; 69(7): 3687-94.

17. Ishii S., Sadowsky M.J. Escherichia coli in the environment: implications for water quality and human health. Microbes Environ. 2008; 23(2): 101-8. https://doi.org/10.1264/jsme2.23.101

18. Bagley S.T. Habitat association of Klebsiella species. Infect. Control. 1985; 6(2): 52-8. https://doi.org/10.1017/s0195941700062603

19. Wellington E.M.H., Boxall A.B.A., Cross P., Feil E.J., Gaze W.H., Hawkey P.M., et al. The role of the natural environment in the emergence of antibiotic resistance in Gram-negative bacteria. Lancet Infect. Dis. 2013; 13(2): 155-65. https://doi.org/10.1016/s1473-3099(12)70317-1

20. Ramirez M.S., Traglia G.M., Lin D.L., Tran T., Tolmasky M.E. Plasmid-mediated antibiotic resistance and virulence in gram-negatives: the Klebsiella pneumoniae paradigm. Microbiol. Spectr. 2014; 2(5). https://doi.org/10.1128/microbiolspec.PLAS-0016-2013

21. Pass M.A., Odedra R., Batt R.M. Multiplex PCRs for identification of Escherichia coli virulence genes. J. Clin. Microbiol. 2000; 38(5): 2001-4. https://doi.org/10.1128/JCM.38.5.2001-2004.2000

22. Paton A.W., Paton J.C. Detection and characterization of Shiga toxigenic Escherichia coli by using multiplex PCR assays for stx1, stx2, eaeA, Enterohemorrhagic E. coli hlyA, rfbO111, and rfbO15. J. Clin. Microbiol. 1998; 36(2): 598-602. https://doi.org/10.1128/JCM.36.2.598-602.1998

23. Toma C., Lu Y., Higa N., Nakasone N., Chinen I., Baschkier A., et al. Multiplex PCR assay for identification of human diarrheagenic Escherichia coli. J. Clin. Microbiol. 2003; 41(6): 2669-71. https://doi.org/10.1128/JCM.41.6.2669-2671.2003

24. Compain F., Babosan A., Brisse S., Genel N., Audo J., Ailloud F., et al. Multiplex PCR for detection of seven virulence factors and K1/K2 capsular serotypes of Klebsiella pneumoniae. J. Clin. Microbiol. 2014; 52(12): 4377-80. https://doi.org/10.1128/JCM.02316-14

25. Clermont O., Bonacorsi S., Bingen E. Rapid and simple determination of the Escherichia coli phylogenetic group. Appl. Environ. Microbiol. 2000; 66(10): 4555-8. https://doi.org/10.1128/AEM.66.10.4555-4558.2000

26. Анализ произвольных таблиц сопряженности с использованием критерия хи-квадрат. Онлайн калькулятор. Доступно: https://medstatistic.ru/calculators/calchit.html

27. Hofman P., Le Negrate G., Mograbi B., Hofman V., Brest P., Alliana-Schmid A., et al. Escherichia coli cytotoxic necrotizing factor-1 (CNF-1) increases the adherence to epithelia and the oxidative burst of human polymorphonuclear leukocytes but decreases bacteria phagocytosis. J. Leukoc. Biol. 2000; 68(4): 522-8.

28. Gall-Mas L., Fabbri A., Namini M.R.J., Givskov M., Fiorentini C., Krejsgaard T. The bacterial toxin CNF1 induces activation and maturation of human monocyte-derived dendritic cells.Int. J. Mol. Sci. 2018; 19(5): 1408. https://doi.org/10.3390/ijms19051408

29. Desvaux M., Dalmasso G., Beyrouthy R., Barnich N., Delmas J., Bonnet R. Pathogenicity factors of genomic islands in intestinal and extraintestinal Escherichia coli. Front. Microbiol. 2020; 11: 2065. https://doi.org/10.3389/fmicb.2020.02065

30. Ong C.L., Beatson S.A., Totsika M., Forestier C., McEwan A.G., Schembri M.A. Molecular analysis of type 3 fimbrial genes from Escherichia coli, Klebsiella and Citrobacter species. BMC Microbiol. 2010; 10: 183. https://doi.org/10.1186/1471-2180-10-183

31. Yeh K.M., Lin J.C., Yin F.Y., Fung C.P., Hung H.C., Siu L.K., et al. Revisiting the importance of virulence determinant magA and its surrounding genes in Klebsiella pneumoniae causing pyogenic liver abscesses: exact role in serotype K1 capsule formation. J. Infect. Dis. 2010; 201(8): 1259-67. https://doi.org/10.1086/606010