Опыт использования метода времяпролётной масс-спектрометрии для идентификации плесневых грибов

Введение. Метод матрично-ассоциированной лазерной масс-спектрометрии широко применяется в микробиологии в силу точности и быстроты получения результатов. Однако применение этого метода для плесневых грибов представляет ряд трудностей и не всегда эффективно.

Цель и задачи исследования — определить целесообразность практического применения удлинённого протокола с культивированием в жидкой среде и предварительной экстракцией белков в рутинной идентификации плесневых грибов, выделенных из окружающей среды.

Материалы и методы. Проводили анализ музейной коллекции плесневых грибов ФГБУ «ЦСП» ФМБА России методом MALDI-TOF-масс-спектрометрии для видовой идентификации микроорганизмов с помощью системы идентификации Biotyper (Bruker) с предварительным культивированием в жидкой среде и белковой экстракцией муравьиной кислотой и ацетонитрилом по удлинённому оптимизированному протоколу.

Результаты. Проанализировано 137 образцов из коллекции лаборатории микробиологии и паразитологии. Качественные спектры получены для 71,5% изолятов. Идентификация по базе MBT Filamentous Fungi Library с достоверным скором (> 1,7) получена для 55% образцов (26% со скором > 2). Проанализированные образцы включали в себя представителей 19 семейств и 27 родов, 16% образцов демонстрировали спектры высокого качества, но не идентифицировались по базе MBT Filamentous Fungi Library (Bruker).

Ограничения исследования: при изучении возможности использования метода времяпролётной масс-спектрометрии для идентификации плесневых грибов был произведён анализ 137 изолятов плесневых грибов из окружающей среды, что представляет собой достаточную референтную выборку. Проанализированные образцы включали в себя представителей 19 семейств и 27 родов, что позволяет применить полученные выводы по крайней мере к этим представителям мицелиальных грибов. В рамках данного исследования не удалось идентифицировать 22 образца со спектрами высокого качества, поэтому предметом дальнейших исследований будет их идентификация молекулярно-генетическими методами, выявление подобных образцов и создание из них новой собственной базы спектров для MALDI-TOF-биотипирования. Предстоит также расширить перечень изучаемых семейств.

Заключение. Для эффективной идентификация плесневых грибов с помощью масс-спектрометрических методов целесообразно применять культивирование чистой культуры в жидкой среде, оптимизированный протокол пробоподготовки и создание собственной внутрилабораторной базы данных спектров.

Участие авторов:
Курбатова И.В. — концепция и дизайн исследования, сбор материала и микроскопическая идентификация, обработка данных, статистическая обработка, написание текста; редактирование;
Ракитина Д.В. — концепция и дизайн исследования, сбор материала и обработка данных, идентификация методом MALDI-TOF, статистическая обработка, написание текста, редактирование;
Кравченко Е.С. — культивирование образцов;
Мания Т.Р. — написание текста, редактирование;
Асланова М.М. — концепция и дизайн исследования, редактирование;
Юдин С.М. — редактирование.
Все соавторы — утверждение окончательного варианта статьи, ответственность за целостность всех частей статьи.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов в связи с публикацией данной статьи.

Финансирование. Исследование проводилось при поддержке Государственного задания «Разработка унифицированных методов, включающих отбор проб, для осуществления определения микробиологического и паразитологического загрязнения сточных вод» (шифр «Сточные воды») № АААА-А21-121011190012-3.

Поступила: 05.03.2022 / Принята к печати: 12.04.2022 / Опубликована: 31.05.2022

1. Patel R. MALDI-TOF mass spectrometry: transformative proteomics for clinical microbiology. Clin. Chem. 2013; 59(2): 340-2. https://doi.org/10.1373/clinchem.2012.183558

2. McElvania TeKippe E., Burnham C.A. Evaluation of the Bruker Biotyper and VITEK MS MALDI-TOF MS systems for the identification of unusual and/or difficult-to-identify microorganisms isolated from clinical specimens. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 2014; 33(12): 2163-71. https://doi.org/10.1007/s10096-014-2183-y

3. Bilecen K., Yaman G., Ciftci U., Laleli Y.R. Performances and reliability of Bruker Microflex LT and VITEK MS MALDI-TOF mass spectrometry systems for the identification of clinical microorganisms. Biomed Res.Int. 2015; 2015: 516410. https://doi.org/10.1155/2015/516410

4. Levesque S., Dufresne P.J., Soualhine H., Domingo M.C., Bekal S., Lefebvre B., et al. A side by side comparison of Bruker Biotyper and VITEK MS: Utility of MALDI-TOF MS technology for microorganism identification in a public health reference laboratory. PLoS One. 2015; 10(12): e0144878. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0144878

5. Chen Y., Prior B.A., Shi G., Wang Z. A rapid PCR-based approach for molecular identification of filamentous fungi. J. Microbiol. 2011; 49(4): 675-9. https://doi.org/10.1007/s12275-011-0525-3

6. Diguta C.F., Vincent B., Guilloux-Benatier M., Alexandre H., Rousseaux S. PCR ITS-RFLP: A useful method for identifying filamentous fungi isolates on grapes. Food Microbiol. 2011; 28(6): 1145-54. https://doi.org/10.1016/j.fm.2011.03.006

7. Ferrer C., Colom F., Frasés S., Mulet E., Abad J.L., Alió J.L. Detection and identification of fungal pathogens by PCR and by ITS2 and 5.8S ribosomal DNA typing in ocular infections. J. Clin. Microbiol. 2001; 39(8): 2873-9. https://doi.org/10.1128/JCM.39.8.2873-2879.2001

8. Normand A.C., Cassagne C., Gautier M., Becker P., Ranque S., Hendrickx M., et al. Decision criteria for MALDI-TOF MS-based identification of filamentous fungi using commercial and in-house reference databases. BMC Microbiol. 2017; 17(1): 25. https://doi.org/10.1186/s12866-017-0937-2

9. Gómez-Velásquez J.C., Loaiza-Díaz N., Norela Hernández G., Lima N., Mesa-Arango A.C. Development and validation of an in-house library for filamentous fungi identification by MALDI-TOF MS in a clinical laboratory in Medellin (Colombia). Microorganisms. 2020; 8(9): 1362. https://doi.org/10.3390/microorganisms8091362

10. Zvezdanova M.E., Escribano P., Ruiz A., Martínez-Jiménez M.C., Peláez T., Collazos A., et al. Increased species-assignment of filamentous fungi using MALDI-TOF MS coupled with a simplified sample processing and an in-house library. Med. Mycol. 2019; 57(1): 63-70. https://doi.org/10.1093/mmy/myx154

11. Stein M., Tran V., Nichol K.A., Lagacé-Wiens P., Pieroni P., Adam H.J., et al. Evaluation of three MALDI-TOF mass spectrometry libraries for the identification of filamentous fungi in three clinical microbiology laboratories in Manitoba, Canada. Mycoses. 2018; 61(10): 743-53. https://doi.org/10.1111/myc.12800

12. Wilkendorf L.S., Bowles E., Buil J.B., van der Lee H.A.L., Posteraro B., Sanguinetti M., et al. Update on matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry identification of filamentous fungi. J. Clin. Microbiol. 2020; 58(12): e01263-20. https://doi.org/10.1128/JCM.01263-20

13. Cassagne C., Ranque S., Normand A.C., Fourquet P., Thiebault S., Planard C., et al. Mould routine identification in the clinical laboratory by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry. PLoS One. 2011; 6(12): e28425. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0028425

14. Chabasse B. Emergence of new fungal pathogens: general review. Rev. Francoph. Lab. 2009; 416: 71-87.

15. Peng Y., Zhang Q., Xu C., Shi W. MALDI-TOF MS for the rapid identification and drug susceptibility testing of filamentous fungi. Exp. Ther. Med. 2019; 18(6): 4865-73. https://doi.org/10.3892/etm.2019.8118

16. Hendrickx M. MALDI-TOF MS and filamentous fungal identification: a success story? Curr. Fungal Inf. Rep. 2017; 11(2): 60-5. https://doi.org/10.1007/s12281-017-0277-6

17. Reeve M.A., Bachmann D. A method for filamentous fungal growth and sample preparation aimed at more consistent MALDI-TOF MS spectra despite variations in growth rates and/or incubation times. Biol. Methods. Protoc. 2019; 4(1): bpz003. https://doi.org/10.1093/biomethods/bpz003

18. Билай В.И., Коваль Э.З. Аспергиллы. Определитель. Киев: Наукова Думка; 1988.

19. Билай В.И., Курбацкая З.А. Определитель токсинобразующих микромицетов. Киев: Наукова Думка; 1990.

20. Саттон Д., Фотергилл А., Ринальди М. Определитель патогенных и 103 условно патогенных грибов. М.: Мир; 2001.

21. Booth С. The genus Fusarium.Commonwealth Mycological Inst. Kew, Surrey; 1971.

22. Pitt J.I. A Laboratory Guide to Common Penicillium Species.Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization. North Wales; 1991.

23. Schulthess B., Ledermann R., Mouttet F., Zbinden A., Bloemberg G.V., Böttger E.C., et al. Use of the Bruker MALDI Biotyper for identification of molds in the clinical mycology laboratory. J. Clin. Microbiol. 2014; 52(8): 2797-803. https://doi.org/10.1128/JCM.00049-14.

24. Ning Y.T., Yang W.H., Zhang W., Xiao M., Wang Y., Zhang J.J., et al. Developing two rapid protein extraction methods using focused-ultrasonication and zirconia-silica beads for filamentous fungi identification by MALDI-TOF MS. Front. Cell. Infect. Microbiol. 2021; 11: 687240. https://doi.org/10.3389/fcimb.2021.687240

25. Patel R. A moldy application of MALDI: MALDI-ToF mass spectrometry for fungal identification. J. Fungi (Basel). 2019; 5(1): 4. https://doi.org/10.3390/jof5010004

26. Becker P.T., de Bel A., Martiny D., Ranque S., Piarroux R., Cassagne C., et al. Identification of filamentous fungi isolates by MALDI-TOF mass spectrometry: clinical evaluation of an extended reference spectra library. Med. Mycol. 2014; 52(8): 826-34. https://doi.org/10.1093/mmy/myu064