Оценка воздействия промышленных одностенных и многостенных углеродных нанотрубок на культуры эпителиальных клеток дыхательных путей человека

Введение. В настоящем исследовании проведена сравнительная оценка токсических эффектов промышленных одностенных углеродных нанотрубок (ОУНТ) и многостенных углеродных нанотрубок (МУНТ) в низких дозах, соответствующих производственным экспозициям, на культурах клеток бронхиального эпителия BEAS-2B и альвеолярного эпителия A549.

Материалы и методы. Распределение по размерам агломератов ОУНТ и МУНТ в дисперсиях оценивалось методами динамического светорассеяния и просвечивающей электронной микроскопии. Оценка цитотоксичности проводилась с помощью MTS-теста и определения лактатдегидрогеназы (ЛДГ) в клеточном супернатанте. Визуализация взаимодействия углеродных нанотрубок (УНТ) с клетками осуществлялась с использованием темнопольной и просвечивающей электронной микроскопии.

Результаты. Данные MTS-теста и ЛДГ-теста свидетельствуют о цитотоксичности неочищенных ОУНТ и МУНТ в диапазоне концентраций 50–200 мкг/мл и очищенных ОУНТ в диапазоне 25–200 мкг/мл в отношении клеток BEAS-2B. Показано, что наиболее подходящей моделью для изучения УНТ является клеточная культура бронхиального эпителия человека BEAS-2B. Выявлено, что ОУНТ и МУНТ проникают в цитоплазму клеток BEAS-2B и А549, при этом МУНТ чаще обнаруживаются во внутриклеточном содержимом в виде вакуолизированных скоплений, тогда как единичные и агломераты ОУНТ визуализируются в цитоплазме без тенденции к вакуолизации.

Ограничения исследования. Внесение УНТ в клетки осуществлялось в виде дисперсий, где обнаруживались как единичные нанотрубки, так и их агломераты. Также в настоящем исследовании расчёт концентраций УНТ для внесения в клетки был основан на компьютерном моделировании.

Заключение. Различия в проникновении УНТ в клетки могут быть объяснены структурными особенностями: агломераты МУНТ в несколько раз меньше по сравнению с ОУНТ, что облегчает их захват клетками. Дальнейшее изучение механизмов цитотоксического и генотоксического действия разных типов УНТ может способствовать выявлению особенностей воздействия МУНТ и ОУНТ на клетки дыхательной системы для разработки методологических подходов к безопасному использованию УНТ.

Соблюдение этических стандартов. Исследование не требует представления заключения комитета по биомедицинской этике или иных документов.

Участие авторов:
Габидинова Г.Ф. — обзор литературы по теме исследования, культивирование клеток, проведение тестов (ЛДГ) на клетках, статистическая обработка данных, построение рисунков, обобщение полученных результатов;
Тимербулатова Г.А. — обзор литературы по теме исследования, культивирование клеток, проведение тестов (MTS) на клетках, построение рисунков, обобщение полученных результатов;
Даминова А.Г. — проведение просвечивающей электронной микроскопии, морфометрии суспензий;
Галялтдинов Ш.Ф. — подготовка суспензий материалов для внесения в клетки;
Димиев А.М. — разработка методов подготовки суспензий материалов для внесения в клетки;
Крючкова М.А. — разработка методов визуализации наноматериалов в клетках (темнопольная микроскопия);
Фахруллин Р.Ф. — разработка методов визуализации наноматериалов в клетках (темнопольная микроскопия);
Фатхутдинова Л.М. — дизайн исследования, анализ материала, редактирование, подготовка статьи к публикации.
Все соавторы — утверждение окончательного варианта статьи, ответственность за целостность всех частей статьи.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов в связи с публикацией данной статьи.

Финансирование. Исследование выполнено за счёт средств гранта Российского научного фонда № 22-25-00512, https://rscf.ru/project/22-25-00512/

Поступила: 27.10.2022 / Принята к печати: 08.12.2022 / Опубликована: 12.01.2023

1. Venkataraman A., Amadi E.V., Chen Y., Papadopoulos C. Carbon nanotube assembly and integration for applications. Nanoscale Res. Lett. 2019; 14(1): 220. https://doi.org/10.1186/s11671-019-3046-3

2. Chetyrkina M.R., Fedorov F.S., Nasibulin A.G. In vitro toxicity of carbon nanotubes: a systematic review. RSC Adv. 2022; 12(25): 16235-56. https://doi.org/10.1039/d2ra02519a

3. Alshehri R., Ilyas A.M., Hasan A., Arnaout A., Ahmed F., Memic A. Carbon Nanotubes in Biomedical Applications: Factors, Mechanisms, and Remedies of Toxicity. J. Med. Chem. 2016; 59(18): 8149-67. https://doi.org/10.1021/acs.jmedchem.5b01770

4. Pietroiusti A., Stockmann-Juvala H., Lucaroni F., Savolainen K. Nanomaterial exposure, toxicity, and impact on human health. Wiley Interdiscip. Rev. Nanomed. Nanobiotechnol. 2018; 10(5): e1513. https://doi.org/10.1002/wnan.1513

5. Luanpitpong S., Wang L., Rojanasakul Y. The effects of carbon nanotubes on lung and dermal cellular behaviors. Nanomedicine (Lond). 2014; 9(6): 895-912. https://doi.org/10.2217/nnm.14.42

6. Siegrist K.J., Reynolds S.H., Porter D.W., Mercer R.R., Bauer A.K., Lowry D., et al. Mitsui-7, heat-treated, and nitrogen-doped multi-walled carbon nanotubes elicit genotoxicity in human lung epithelial cells. Part. Fibre Toxicol. 2019; 16(1): 36. https://doi.org/10.1186/s12989-019-0318-0

7. Lindberg H.K., Falck G.C., Singh R., Suhonen S., Järventaus H., Vanhala E., et al. Genotoxicity of short single-wall and multi-wall carbon nanotubes in human bronchial epithelial and mesothelial cells in vitro. Toxicol. 2013; 313(1): 24-37. https://doi.org/10.1016/j.tox.2012.12.008

8. Haniu H., Saito N., Matsuda Y., Tsukahara T., Usui Y., Maruyama K., et al. Biological responses according to the shape and size of carbon nanotubes in BEAS-2B and MESO-1 cells.Int. J. Nanomed. 2014; 9: 1979-90. https://doi.org/10.2147/IJN.S58661

9. Jia G., Wang H., Yan L., Wang X., Pei R., Yan T., et al. Cytotoxicity of carbon nanomaterials: single-wall nanotube, multi-wall nanotube, and fullerene. Environ. Sci. Technol. 2005; 39(5): 1378-83. https://doi.org/10.1021/es048729l

10. Халиуллин Т.О., Кисин Е.Р., Мюррэй Р.Э., Залялов Р.Р., Шведова А.А., Фатхутдинова Л.М. Токсические эффекты углеродных нанотрубок в культурах клеток макрофагов и бронхиального эпителия. Вестник Томского государственного университета. Биология. 2014; (1): 199-210

11. Hu X., Cook S., Wang P., Hwang H.M., Liu X., Williams Q.L. In vitro evaluation of cytotoxicity of engineered carbon nanotubes in selected human cell lines. Sci. Total Environ. 2010; 408(8): 1812-7. https://doi.org/10.1016/j.scitotenv.2010.01.035

12. Murr L.E., Garza K.M., Soto K.F., Carrasco A., Powell T.G., Ramirez D.A., et al. Cytotoxicity assessment of some carbon nanotubes and related carbon nanoparticle aggregates and the implications for anthropogenic carbon nanotube aggregates in the environment.Int. J. Environ. Res. Public Health. 2005; 2(1): 31-42. https://doi.org/10.3390/ijerph2005010031

13. Palomäki J., Karisola P., Pylkkänen L., Savolainen K., Alenius H. Engineered nanomaterials cause cytotoxicity and activation on mouse antigen presenting cells. Toxicol. 2010; 267(1-3): 125-31. https://doi.org/10.1016/j.tox.2009.10.034

14. Тимербулатова Г.А., Фатхутдинова Л.М. Токсичность одностенных углеродных нанотрубок, исследованная на различных типах культур клеток (обзор современного состояния проблемы). Российские нанотехнологии. 2018; 13(5-6): 26-31

15. Grosse Y., Loomis D., kio Guyton K.Z., Lauby-Secretan B., El Ghissassi F., Bouvard V., et al.International Agency for Research on Cancer Monograph Working Group. Carcinogenicity of fluoro-edenite, silicon carbide fibres and whiskers, and carbon nanotubes. Lancet Oncol. 2014; 15(13): 1427-8. https://doi.org/10.1016/S1470-2045(14)71109-X

16. Ghosh M., Murugadoss S., Janssen L., Cokic S., Mathyssen C., Van Landuyt K., et al. Distinct autophagy-apoptosis related pathways activated by Multi-walled (NM 400) and Single-walled carbon nanotubes (NIST-SRM2483) in human bronchial epithelial (16HBE14o-) cells. J. Hazard. Mater. 2020; 387: 121691. https://doi.org/10.1016/j.jhazmat.2019.121691

17. Caoduro C., Hervouet E., Girard-Thernier C., Gharbi T., Boulahdour H., Delage-Mourroux R., et al. Carbon nanotubes as gene carriers: Focus on internalization pathways related to functionalization and properties. Acta Biomater. 2017; 49: 36-44. https://doi.org/10.1016/j.actbio.2016.11.013

18. Kang B., Chang S., Dai Y., Yu D., Chen D. Cell response to carbon nanotubes: size-dependent intracellular uptake mechanism and subcellular fate. Small. 2010; 6(21): 2362-6. https://doi.org/10.1002/smll.201001260

19. Raffa V., Ciofani G., Nitodas S., Karachalios T., D’Alessandro D., Masini M., et al. Can the properties of carbon nanotubes influence their internalization by living cells? Carbon. 2008; 46: 1600-10. https://doi.org/10.1016/j.carbon.2008.06.053

20. Han Y.G., Xu J., Li Z.G., Ren G.G., Yang Z. In vitro toxicity of multi-walled carbon nanotubes in C6 rat glioma cells. Neurotoxicol. 2012; 33(5): 1128-34. https://doi.org/10.1016/j.neuro.2012.06.004

21. Ema M., Takehara H., Naya M., Kataura H., Fujita K., Honda K. Length effects of single-walled carbon nanotubes on pulmonary toxicity after intratracheal instillation in rats. J. Toxicol. Sci. 2017; 42(3): 367-78. https://doi.org/10.2131/jts.42.367

22. Migliore L., Saracino D., Bonelli A., Colognato R., D’Errico M.R., Magrini A., et al. Carbon nanotubes induce oxidative DNA damage in RAW 264.7 cells. Environ. Mol. Mutagen. 2010; 51(4): 294-303. https://doi.org/10.1002/em.20545

23. Ursini C.L., Cavallo D., Fresegna A.M., Ciervo A., Maiello R., Buresti G., et al. Differences in cytotoxic, genotoxic, and inflammatory response of bronchial and alveolar human lung epithelial cells to pristine and COOH-functionalized multiwalled carbon nanotubes. Biomed. Res.Int. 2014; 2014: 359506. https://doi.org/10.1155/2014/359506

24. Eldawud R., Wagner A., Dong C., Stueckle T.A., Rojanasakul Y., Dinu C.Z. Carbon nanotubes physicochemical properties influence the overall cellular behavior and fate. NanoImpact. 2018; 9: 72-84. https://doi.org/10.1016/j.impact.2017.10.006

25. Guseva Canu I., Bateson T.F., Bouvard V., Debia M., Dion C., Savolainen K., et al. Human exposure to carbon-based fibrous nanomaterials: A review.Int. J. Hyg. Environ. Health. 2016; 219(2): 166-75. https://doi.org/10.1016/j.ijheh.2015.12.005

26. Donaldson K., Aitken R., Tran L., Stone V., Duffin R., Forrest G., et al. Carbon nanotubes: a review of their properties in relation to pulmonary toxicology and workplace safety. Toxicol. Sci. 2006; 92(1): 5-22. https://doi.org/10.1093/toxsci/kfj130

27. Multiple-Path Particle Dosimetry Model (MPPD v 3.04). Available at: https://www.ara.com/products/multiple-path-particle-dosimetry-model-mppd-v-304

28. Тимербулатова Г.А., Димиев А.М., Хамидуллин Т.Л., Бойчук С.В., Дунаев П.Д., Фахруллин Р.Ф. и др. Диспергирование одностенных углеродных нанотрубок в биосовместимых средах. Российские нанотехнологии. 2020; 15(4): 461-9. https://doi.org/10.1134/S1992722320040160

29. Davoren M., Herzog E., Casey A., Cottineau B., Li Y., Boraschi D. Endotoxin contamination: a key element in the interpretation of nanosafety studies. Nanomed. Lond. 2016; 11(3): 269. https://doi.org/10.221/nnm.15.19619

30. Чередниченко Ю.В., Евтюгин В.Г., Нигаматзянова Л.Р., Ахатова Ф.С., Рожина Э.В., Фахруллин Р.Ф. Синтез наночастиц серебра при помощи ультразвука и галлуазита для создания нанокомпозита с антибактериальными свойствами. Российские нанотехнологии. 2019; 14(9-10): 64-70. https://doi.org/10.21517/1992-7223-2019-9-10-64-70

31. Fakhrullin R., Nigamatzyanova L., Fakhrullina G. Dark-field/hyperspectral microscopy for detecting nanoscale particles in environmental nanotoxicology research. Sci. Total Environment. 2021; 772: 145478. https://doi.org/10.1016/j.scitotenv.2021.145478

32. Mohd Nurazzi N., Asyraf M.R.M., Khalina A., Abdullah N., Sabaruddin F.A., Kamarudin S.H., et al. Fabrication, functionalization, and application of carbon nanotube-reinforced polymer composite: an overview. Polymers (Basel). 2021; 13(7): 1047. https://doi.org/10.3390/polym13071047

33. Dong J., Ma Q. Suppression of basal and carbon nanotube-induced oxidative stress, inflammation and fibrosis in mouse lungs by Nrf2. Nanotoxicol. 2016; 10(6): 699-709. https://doi.org/10.3109/17435390.2015.1110758

34. Gupta S.S., Singh K.P., Gupta S., Dusinska M., Rahman Q. Do carbon nanotubes and asbestos fibers exhibit common toxicity mechanisms? Nanomaterials (Basel). 2022; 12(10): 1708. https://doi.org/10.3390/nano12101708

35. Ursini C.L., Maiello R., Ciervo A., Fresegna A.M., Buresti G., Superti F., et al. Evaluation of uptake, cytotoxicity and inflammatory effects in respiratory cells exposed to pristine and -OH and -COOH functionalized multi-wall carbon nanotubes. J. Appl. Toxicol. 2016; 36(3): 394-403. https://doi.org/10.1002/jat.3228

36. Davoren M., Herzog E., Casey A., Cottineau B., Chambers G., Byrne H.J., et al. In vitro toxicity evaluation of single walled carbon nanotubes on human A549 lung cells. Toxicol. In Vitro. 2007; 21(3): 438-48. https://doi.org/10.1016/j.tiv.2006.10.007