Методика выделения ДНК из образцов почвы

Введение. Даже в городских условиях человек находится в постоянном контакте с почвой как объектом окружающей среды. При этом с почвенным загрязнением могут переноситься различные патогены, в том числе и опасные для животных и человека. В связи с этим остро стоит вопрос разработки методик для совершенствования мониторинга таких патогенных объектов. Метод ПЦР широко применяется в лабораторной практике, позволяя выявить и некультивируемые типы патогенов.

Цели и задачи — подобрать методику эффективного выделения из почвенных образцов ДНК, пригодной для проведения ПЦР-анализа.

Материалы и методы. Выделение ДНК из образцов поверхностного слоя дерново-подзолистого грунта проводили с использованием как химических реактивов, так и готовых коммерческих (но не специализированных) наборов. ПЦР-анализ проводили методом детекции в режиме реального времени.

Результаты. Проанализировано четыре основных метода выделения ДНК из почвы в различных сочетаниях друг с другом и с тремя видами предварительной и постобработки. Хотя ДНК выделялась из почвы всеми методами, но без дополнительной очистки она была непригодна для постановки ПЦР. Показана необходимость обработки образцов солями кальция для удаления гуминовых кислот, ингибирующих ПЦР. В результате выбраны два метода выделения ДНК из почвы. В обоих первые стадии сочетали метод с использованием бромида цетримония (CTAB) и предобработку CaCO₃. Более чувствительный и более дешёвый метод предполагает на третьей стадии постобработку CaCl₂. Другой метод сильно уступает в чувствительности, но выигрывает в воспроизводимости, при его использовании третья стадия включает очистку на колонках из набора Qiagen.

Ограничения исследования. При отработке методики выделения ДНК для ПЦР-анализа были изучены образцы только одного типа почв — дерново-подзолистого грунта. Поэтому методика может быть применена только для этого типа почв.

Заключение. Разработанные методы применимы при оценке с применением метода ПЦР загрязнённости почв дерново-подзолистого типа патогенными организмами.

Участие авторов:
Ракитина Д.В. — концепция и дизайн исследования, отбор образцов, написание текста, выделение ДНК и ПЦР-анализ;
Асланова М.М. — концепция и дизайн исследования, отбор образцов, написание текста;
Мания Т.Р. — редактирование.
Все соавторы — утверждение окончательного варианта статьи, ответственность за целостность всех частей статьи.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов в связи с публикацией данной статьи.

Финансирование. Исследование проведено в рамках НИР «Разработка унифицированных методов, включающих отбор проб, для осуществления определения микробиологического и паразитологического загрязнения сточных вод» (шифр «Сточные воды») АААА-А21-121011190012-3.

Поступила: 09.02.2022 / Принята к печати: 21.04.2022 / Опубликована: 31.05.2022

1. Steffan J.J., Derby J.A., Brevik E.C. Soil pathogens that may potentially cause pandemics, including severe acute respiratory syndrome (SARS) coronaviruses. Curr. Opin. Environ. Sci. Health. 2020; 17: 35-40. https://doi.org/10.1016/j.coesh.2020.08.005

2. Jourdan P.M., Lamberton P.H.L., Fenwick A., Addiss D.G. Soil-transmitted helminth infections. Lancet. 2018; 391(10117): 252-65. https://doi.org/10.1016/S0140-6736(17)31930-X

3. Zhou J., Bruns M.A., Tiedje J.M. DNA recovery from soils of diverse composition. Appl. Environ. Microbiol. 1996; 62(2): 316-22. https://doi.org/10.1128/aem.62.2.316-322.1996

4. Schrader C., Schielke A., Ellerbroek L., Johne R. PCR inhibitors - occurrence, properties and removal. J. Appl. Microbiol. 2012; 113(5): 1014-26. https://doi.org/10.1111/j.1365-2672.2012.05384.x

5. Porebski S., Bailey L.G., Baum B.R. Modification of a CTAB DNA extraction protocol for plants containing high polysaccharide and polyphenol components. Plant Mol. Biol. Rep. 1997; 15(1): 8-15. https://doi.org/10.1007/BF02772108

6. Verma S.K., Singh H., Sharma P.C. An improved method suitable for isolation of high-quality metagenomic DNA from diverse soils. 3 Biotech. 2017; 7(3): 171. https://doi.org/10.1007/s13205-017-0847-x

7. Yeates C., Gillings M. Rapid purification of DNA from soil for molecular biodiversity analysis. Lett. Appl. Microbiol. 1998; 27(1): 49-53. https://doi.org/10.1046/j.1472-765X.1998.00383.x

8. Sagova-Mareĉkova M., Cermak L., Novotna J., Plhackova K., Forstova J., Kopecky J. Innovative methods for soil DNA purification tested in soils with widely differing characteristics. Appl. Environ. Microbiol. 2008; 74(9): 2902-7. https://doi.org/10.1128/AEM.02161-07

9. Charlop-Powers Z., Pregitzer C.C., Lemetre C., Ternei M.A., Maniko J., Hover B.M., et al. Urban Park soil microbiomes are a rich reservoir of natural product biosynthetic diversity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2016; 113(51): 14811-6. https://doi.org/10.1073/pnas.1615581113

10. Braid M.D., Daniels L.M., Kitts C.L. Removal of PCR inhibitors from soil DNA by chemical flocculation. J. Microbiol. Methods. 2003; 52(3): 389-93. https://doi.org/10.1016/s0167-7012(02)00210-5

11. Sharma S., Sharma K.K., Kuhad R.C. An efficient and economical method for extraction of DNA amenable to biotechnological manipulations, from diverse soils and sediments. J. Appl. Microbiol. 2014; 116(4): 923-33. https://doi.org/10.1111/jam.12420

12. Barbarić L., Bačić I., Grubić Z. Powdered activated carbon: an alternative approach to genomic DNA purification. J. Forensic. Sci. 2015; 60(4): 1012-5. https://doi.org/10.1111/1556-4029.12773

13. Herlemann D.P.R., Labrenz M., Juergens K., Bertilsson S., Waniek J.J., Anderrson A.F. Transition in bacterial communities along the 2000 km salinity gradient of the Baltic Sea. ISME J. 2011; 5(10): 1571-9. https://doi.org/10.1038/ismej.2011.41

14. Bürgmann H., Pesaro M., Widmer F., Zeyer J. A strategy for optimizing quality and quantity of DNA extracted from soil. J. Microbiol. Methods. 2001; 45(1): 7-20. https://doi.org/10.1016/s0167-7012(01)00213-5

15. Baidoo R., Yan G., Nelson B., Skantar A.M., Chen S. Use of chemical flocculation and nested PCR for Heterodera glycines detection in DNA extracts from field soils with low population densities. Plant Dis. 2017; 101(7): 1153-61. https://doi.org/10.1094/PDIS-08-16-1163-RE

16. Miller D.N., Bryant J.E., Madsen E.L., Ghiorse W.C. Evaluation and optimization of DNA extraction and purification procedures for soil and sediment samples. Appl. Environ. Microbiol. 1999; 65(11): 4715-24. https://doi.org/10.1128/aem.65.11.4715-4724.1999

17. Frostegård A., Courtois S., Ramisse V., Clerc S., Bernillon D., Le Gall F., et al. Quantification of bias related to the extraction of DNA directly from soils. Appl. Environ. Microbiol. 1999; 65(12): 5409-20. https://doi.org/10.1128/aem.65.12.5409-5420.1999

18. He J., Xua Z., Hughes J. Pre-lysis washing improves DNA extraction from a forest soil. Soil Biol. Biochem. 2005; 37(12): 2337-41. https://doi.org/10.1016/j.soilbio.2005.04.016