Влияние нефтепродуктов на микробиом водной среды. Контроль безопасности

Введение

Возрастающая химизация производства и быта приводит к загрязнению окружающей среды химическими веществами органической природы. По данным ежегодной статистической отчётности Роспотребнадзора, более трети поверхностных водных объектов России (40%) имеют химическое и микробное загрязнение, превышающее во много раз гигиенические нормативы, что полностью исключает возможность их использования для любых целей. Негативное воздействие органических веществ, таких как нефть и нефтепродукты, на среду обитания отдельных территорий Российской Федерации неблагоприятно отражается на формировании микробиоценозов среды и микробиоты человека, действие которых недостаточно изучено [1]. Разливы нефти и нефтепродуктов представляют собой одну из наиболее острых экологических проблем, оказывая разрушительное воздействие на окружающую среду и здоровье человека [2]. При попадании нефти в воду или почву происходит выделение токсичных веществ, обладающих канцерогенными и мутагенными свойствами, что может привести к серьёзным нарушениям в организме человека при длительном воздействии [3]. При попадании нефти и продуктов её переработки в водоёмы они распространяются по поверхности, нарушая естественную экосистему и делая воду непригодной для питья и использования в быту [4]. Так, только Атлантический океан получает ежегодно 190 000–760 000 т отходов нефтепродуктов, а Средиземное море – до 2,1 млн тонн, при этом морская рыба как основное звено пищевой цепи в морях умеренных широт нередко поглощает мелкие частицы нефти. Передвигаясь по пищевой цепи, нефтепродукты могут дойти до человека. В связи с этим возникает необходимость раннего определения влияния нефтепродуктов на специфические группы бактерий, которые используют это вещество в качестве энергетического и конструктивного субстрата [5–7].

Проблема выявления основных закономерностей и механизмов взаимодействия нефти и нефтепродуктов на компоненты микробиоценоза пресноводной системы и почвы с выявлением токсических эффектов и оценкой зависимости «доза – эффект» изучена недостаточно [8–11]. Состояние водных объектов подтверждает необходимость разработки унифицированной системы оценки природно-рекреационного потенциала водных объектов, учитывающей региональную специфику состояния поверхностных вод.

В последние годы водный фактор вносит значительный вклад в заболеваемость острыми кишечными инфекциями (ОКИ) в связи с тем, что современная окружающая среда испытывает мощное влияние факторов антропотехногенного характера, к числу которых можно отнести загрязнения химической природы, которые определённым образом влияют на микробные сообщества водных объектов. При их воздействии в клетках микроорганизмов происходят деградационные изменения, способные привести к ингибированию или размножению популяции бактерий. Влияние поллютантов как стрессовых факторов является причиной фенотипических и генетических изменений, приводящих к увеличению потенциала патогенности бактерий и риску распространения кишечных инфекций среди населения. При этом исследования, посвящённые влиянию органических и неорганических веществ на клетки санитарно-показательных микроорганизмов, в литературе практически не освещены.

Суммарная заболеваемость ОКИ в многолетней динамике характеризуется тенденцией к снижению, но в 2024 г. заболеваемость (456,56 на 100 тыс. населения) превысила уровень 2023 г. (441,5 на 100 тыс. населения) и была на 14% ниже среднемноголетнего показателя (СМП) (527,88 на 100 тыс. населения). Заболеваемость норовирусной инфекцией в 2024 г. превысила уровень 2023 г. на 9% и среднемноголетний уровень в 1,8 раза. Преимущественно регистрируются ОКИ бактериальной природы, удельный вес случаев норовирусной инфекции среди ОКИ составил 42,2%. В 2024 г. на фоне общей тенденции к снижению суммарной заболеваемости ОКИ в многолетней динамике продолжался значительный рост числа очагов инфекций с фекально-оральным механизмом передачи и числа пострадавших в них в сравнении с СМП. По итогам 2024 г. зарегистрировано увеличение количества таких очагов, что на 30,4% превышает СМП (548,4 очага) и на 16,6% уровень 2023 г. (613 очагов). Вызывает тревогу нарастание удельного веса ОКИ неустановленной этиологии, который в 2024 г. составил 62,4%, что свидетельствует о недостаточном внедрении в практическую деятельность современных методов диагностики болезней. В группу риска входят дети в возрасте от 1 года до 6 лет. Удельный вес детского населения среди пострадавших в очагах ОКИ составляет 71,7%, число пострадавших детей в 2024 г. увеличилось на 31% в сравнении со СМП (6382,6 человек) и на 24,5% относительно уровня 2023 г. По величине экономического ущерба ОКИ в структуре инфекционных болезней занимают 4-е место: более 20 млн рублей в 2024 г. [1]. С введением СанПиН 2.1.3685–21¹ расширен перечень санитарно-показательных микроорганизмов и оптимизированы критериальные показатели оценки безопасности водных объектов. Количественный учёт выявляет степень эпидемической опасности различных видов вод и риск развития болезней. Изучение поведения индикаторных микроорганизмов в водной среде с повышенным содержанием органических и неорганических веществ является необходимым условием адекватной оценки риска возникновения и распространения инфекций.

Цель исследования – изучение жизнеспособности микробиома водной среды в условиях повышенной нагрузки нефтепродуктов на водные объекты.

Материалы и методы

Состояние микробных сообществ в воде водных объектов изучали в экспериментальных условиях с добавлением таких нефтепродуктов, как бензин неэтилированный марки АИ-95 (прозрачная лёгкая фракция) и мазут топочный марки М-100 (вязкая жидкость чёрного цвета). Для изучения зависимости изменения санитарно-показательных и патогенных микроорганизмов от концентрации нефтепродукта в водной среде использовали метод моделирования. Для этих целей создавали 28 модельных водоёмов с добавлением бензина АИ-95 в концентрациях на уровне ПДК (0,1 мг/дм³), 10 ПДК, 100 ПДК, 1000 ПДК и искусственным внесением суспензии тест-микроорганизмов Еscherichia сoli 1257, Enterococcus faecalis АТСС 29212, Salmonella typhimurium 5715 и Pseudomonas aeruginosa АТСС 27853 в инфицирующей дозе 10² КОЕ/дм³, 10³ КОЕ/дм³, 10⁴ КОЕ/дм³.

Влияние мазута на микрофлору изучали на 16 модельных водоёмах, предварительно заражённых дикими штаммами микроорганизмов, выделенными из морской воды (Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Enterococcus faecalis), а также тест-штаммами Staphylococcus aureus АТСС 25923, S. enterica (подвид enterica, серотип enteritidis АТСС 13076) в концентрациях 10³ КОЕ/дм³ в двух вариантах внесения нефтепродукта после его разогревания до температуры плюс 60 °С на водяной бане. В половину водоёмов мазут наслаивали так, чтобы образовалась плёнка толщиной 1 см, покрывающая всю поверхность водоёма. Во вторую половину водоёмов мазут вносили каплями, создавая водомазутную эмульсию в виде гранул мазута в воде. В качестве воды для модельных водоёмов использовали речную воду, отобранную на расстоянии 10 м от берега и соответствующую требованиям СанПиН 1.2.3685–21 по микробиологическим показателям.

Модельные водоёмы выдерживали в условиях лаборатории при температуре плюс 22 ± 1 °С. Эксперимент по изучению воздействия бензина на санитарно-показательные и патогенные микроорганизмы продолжался 14 сут, мазута – 30 сут. Для исследования отобрано 285 проб воды. Пробы для определения общего микробного числа (ОМЧ) высевали в двух повторностях на чашки Петри по 1 мл глубинным методом с использованием ГРМ-агара. Инкубацию проводили при температуре плюс 37 ± 1 °С для обнаружения аллохтонной (транзиторной) микрофлоры воды и при температуре плюс 22 ± 1 °С для выявления аутохтонной (естественной) микрофлоры. Посев проб воды из модельных водоёмов, заражённых микроорганизмами в виде нативной суспензии и десятикратных разведений, проводили методом мембранной фильтрации с наложением фильтров для определения E. сoli на хромогенный колиформ-агар, E. faecalis – на среду энтерококкагар, S. typhimurium и S. enteritidis – на среду гектоенагар, P. aeruginosa – на цитримидный агар, S. aureus – на желточно-солевой агар с последующей инкубацией при температуре плюс 37 ± 1 °С в течение 24–48 ч. Для исследования Salmonella spp. использовали метод мембранной фильтрации, не предусмотренный утверждёнными методическими документами, для точного определения количественного содержания микроорганизмов в модельных водоёмах. Обобщение и обработку полученных результатов проводили методом параметрической и непараметрической статистики. Различия величин показателей оценивали по коэффициенту Стьюдента (t_эмп), измерение силы и направленности для двух переменных осуществляли по величине коэффициента Спирмена.

Результаты

Полученные результаты исследования свидетельствуют о том, что изменение количества микрофлоры в воде водоёмов с концентрацией ПДК и 10 ПДК бензина имело однонаправленную тенденцию к снижению в течение первых 48 ч (t_эмп = 2) и увеличению массы клеток в течение 6–14 сут (t_эмп = 3 – зона незначимых изменений). В воде водоёма с концентраций 100 ПДК бензина в первые 24 ч наблюдалось преимущественное снижение аллохтонной микрофлоры до 89,3%, снижение естественной аутохтонной микрофлоры было менее выражено – в пределах 50,5%. В то же время в водоёме с содержанием 1000 ПДК бензина наблюдалась достоверная гибель как аллохтонной, так и аутохтонной микрофлоры на уровне 92% (t_эмп = 12) по сравнению с контролем, которая достигала критических значений к 48 ч эксперимента и приводила к резкому торможению процессов самоочищения воды водоёмов (см. таблицу).

Оставшаяся устойчивая микрофлора в воде опытных водоёмов была способна утилизировать углеводороды и на 6-е сутки эксперимента начинала активно размножаться. В воде водоёма с концентрацией бензина на уровне ПДК и 10 ПДК наблюдалось нарастание массы естественной микрофлоры, превышающей её первоначальный уровень в 4 и 2 раза соответственно, что обеспечивало активизацию процессов самоочищения воды водоёма. В водоёмах с содержанием 100 и 1000 ПДК бензина на 6–14-е сутки скорость отмирания клеток превышала скорость размножения, поэтому процесс самоочищения воды резко замедлился.

Анализ влияния различных концентраций бензина на наличие E. coli – санитарно-показательного микроорганизма, определяющего уровень фекального загрязнения воды, выявил ингибирующее влияние бензина на клетки E. coli при инфицирующей дозе 10³ КОЕ/дм³, которое нарастало с увеличением времени контакта и концентрации бензина (рис. 1).

В воде водоёма с содержанием бензина на уровне ПДК и 10 ПДК в первые сутки контакта жизнеспособность E. coli сохранялась практически на уровне контрольных величин. Влияние бензина на клетки кишечных палочек начинало проявляться на вторые сутки контакта в виде гибели клеток на 49 и 63% соответственно. К 6-м суткам наблюдалась тенденция к снижению числа E. coli уже в пределах одного логарифма, а к 12-м суткам выявлено достоверное снижение их количества в пределах 87 и 97% соответственно. Под влиянием бензина в водоёмах выявлена статистически значимая ассоциация между обнаруживаемыми в воде E. сoli и патогенными микроорганизмами (R² = 0,885) до 12-х суток эксперимента, что свидетельствует об индикаторной значимости E. сoli при оценке безопасности воды с концентрацией нефтепродуктов на уровне ПДК и 10 ПДК.

При увеличении инфицирующей дозы E. сoli до10⁴ КОЕ/дм³ в воде опытных водоёмов сопряжённость E. сoli с патогенными микроорганизмами также сохранялась в течение 12 сут эксперимента. При наличии бензина на уровне 100 и 1000 ПДК наблюдалось прогрессивное снижение числа жизнеспособных клеток E. сoli, в воде водоёма с заражающей дозой 10² КОЕ/дм³ количество клеток E. сoli достоверно снижалось на 99% к 6-м суткам эксперимента, при заражающей дозе 10³ КОЕ/дм³ – на 93 и 96% соответственно, при заражающей дозе 10⁴ КОЕ/ дм³ – на 97 и 98,5% соответственно (t_эмп = 12–18), ассоциативная связь между E. сoli и патогенными бактериями ослабевала (R² = 0,326). На 12-е сутки отмечалась полная гибель клеток E. сoli, реверсии клеток через 48 ч инкубации посевов при температуре плюс 37 ± 1 °С не установлено. Индикаторная значимость E. сoli как показателя безопасности водного объекта к 6-м суткам эксперимента полностью утрачивалась в водоёмах с концентрацией бензина на уровне 100 и 1000 ПДК.

Оценка влияния различных концентраций бензина на грамположительные кокки выполнена на примере Enterococcus faecalis – санитарно-показательного микроорганизма, наличие которого в воде свидетельствует о фекальном загрязнении водоёма. Бензин при попадании в водоём негативно влиял на рост и развитие энтерококков. Количество энтерококков находилось в зависимости от инфицирующей дозы, концентрации нефтепродукта и времени контакта. Тенденция к снижению массы клеток Enterococcus faecalis в воде водоёмов с разной концентрацией бензина и временем контакта повторяла тенденцию снижения клеток E. сoli, выявленную в эксперименте. При инфицирующей дозе Enterococcus faecalis 10³ КОЕ/дм³ в воде с концентрацией бензина на уровне ПДК и 10 ПДК сопряжённость Enterococcus faecalis с патогенными бактериями сохранялась до 6-х суток (R² = 0,865). При увеличении инфицирующей дозы Enterococcus faecalis до 10⁴ КОЕ/дм³ в воде опытных водоёмов теснота связи с патогенными микроорганизмами сохранялась в течение 12 сут эксперимента. В воде водоёмов при наличии бензина на уровне 100 и 1000 ПДК индикаторная значимость Enterococcus faecalis соблюдалась в первые двое суток эксперимента при инфицирующей дозе до 10³ КОЕ/дм³ и 10⁴ КОЕ/дм³.

Результаты экспериментальных исследований по изучению изменения количества Pseudomonas aeruginosa в модельных водоёмах с содержанием различных концентраций бензина (заражающая доза модельного водоёма 10³ КОЕ/дм³) представлены на рис. 2.

Результаты эксперимента по выявлению P. aeruginosa свидетельствуют о наличии прямой зависимости в нарастании массы клеток синегнойной палочки при увеличении концентрации бензина в воде водоёма и времени экспозиции. К 12-м суткам контакта выявлены особенности процесса формирования микробиоты в опытных водоёмах в зависимости от первоначально внесённой дозы клеток по сравнению с уровнем P. аeruginosa, определённым в контрольном водоёме Так, при инфицирующей дозе 10² КОЕ/100 см³ наблюдали активный процесс размножения клеток P. aeruginosa, превышение массы клеток по сравнению с контролем в воде водоёма с концентрацией бензина на уровне ПДК составило в 9,7 раза, 10 ПДК – в 19,8 раза, 100 ПДК – в 24,4 раза, 1000 ПДК – в 28,7 раза. При увеличении инфицирующей дозы до 10⁴ КОЕ/100 см³ в воде водоёма с концентрацией бензина на уровне ПДК выявлено превышение содержания P. aeruginosa по сравнению с контрольным водоёмом в 0,9 раза, 10 ПДК – в 1,2 раза, 100 ПДК – в 1,6 раза, 1000 ПДК – в 2,1 раза, что свидетельствует о замедлении процесса размножения клеток P. аeruginosa за счёт накопления продуктов обмена веществ клеток и истощения питательных компонентов среды.

Влияние мазута на различные группы микроорганизмов в водной среде изучали в зависимости от его способности распределяться в водной среде. При создании водомазутной эмульсии, то есть при капельном распределении мазута на поверхности среды, динамика поведения E. coli характеризовалась тенденцией к снижению роста клеток с первых суток контакта. С 6-х по 20-е сутки жизнеспособность E. coli поддерживалась на уровне контроля с последующим снижением биомассы E. coli к 20-м суткам на 30,7%, к 31-м суткам эксперимента – на 41% по сравнению с контрольным водоёмом (рис. 3).

В то же время количество E. faecalis при капельном распределении мазута определялось на уровне величины биомассы E. coli, и только к 13-м суткам наблюдалось резкое снижение числа клеток E. faecalis до 71% по отношению к контролю, к 20-м суткам – до 95%. На 27-е сутки эксперимента отмечалась 100%-я гибель E. faecalis (рис. 4). Полученные результаты показывают, что мазут оказывал более выраженное угнетающее воздействие на рост и размножение E. faecalis по сравнению с E. coli.

В условиях, когда мазут разливали по поверхности воды водоёма, в результате чего формировалась тонкая плёнка, наблюдалась тенденция к снижению количества кишечной палочки и энтерококка. Количество E. coli снижалось на 96% к 31-му дню наблюдения, E. faecalis погибали на 20-е сутки контакта.

Данные эксперимента показывают, что в течение 20 сут при разливе мазута индикаторная значимость E. faecalis и E. coli сохранялась, о чём свидетельствует возможность обнаружения патогенной микрофлоры в воде. Присутствие мазута в воде, независимо от способа его распределения, приводило к 100%-й гибели клеток S. aureus через 48 ч контакта.

Гибель патогенной микрофлоры S. enterica отмечалась начиная с 6-х суток эксперимента, при этом снижение количества S. enterica в воде достигало 94% при образовании на поверхности тонкой плёнки мазута и 52% – при каплевидном распределении мазута.

Результаты данного эксперимента свидетельствуют о влиянии углеводородов (мазута) в воде на рост и развитие P. aeruginosa. Так, к 31-м суткам эксперимента количество P. aeruginosa достоверно увеличивалось на 3 логарифма по сравнению с контролем, что свидетельствует об активном использовании в метаболизме клеток P. aeruginosa углеводородов, способствующих их размножению.

Обсуждение

Экспериментальными исследованиями доказано усиление неблагоприятного влияния бензина и мазута на состояние естественной микрофлоры воды. Выраженность снижения аутохтонной и аллохтонной микрофлоры находилась в зависимости от увеличения концентрации нефтепродукта и времени контакта.

При концентрации бензина на уровне ПДК процессы самоочищения водоёма протекали активно, жизнеспособность микрофлоры не только сохранялась, но наблюдалось размножение микроорганизмов. В водоёмах с концентрацией бензина 10 ПДК процесс самоочищения воды снижался, а при концентрациях 100 и 1000 ПДК характеризовался как крайне низкий.

Повышенные концентрации нефтепродуктов до 10 ПДК при попадании в воду водоёмов приводили к ингибированию роста санитарно-показательных микроорганизмов E. coli и Е. faecalis – показателей «золотого стандарта» оценки уровня фекального загрязнения воды. Под влиянием бензина в воде водоёмов E. сoli и Е. faecalis сохраняли ассоциативную связь с патогенными микроорганизмами до 12 сут экспозиции, подтверждая индикаторную значимость показателей.

При капельном разливе мазута обеспечивалось поддержание индикаторной значимости у E. сoli до 31 сут, при разливе в виде тонкой плёнки – до 6 сут, у Е. faecalis – до 20 и 13 сут соответственно. Процессы отмирания E. coli, E. faecalis, S. enterica происходили быстрее в модельных водоёмах с мазутом, образующим плёнку на поверхности воды, чем в водоёмах с водомазутной эмульсией.

Удлинение срока выживания диких штаммов E. сoli и Е. faecalis в эксперименте с воздействием мазута характеризует их как более устойчивые по сравнению с музейными штаммами, использованными в эксперименте с бензином.

При концентрации 100 и 1000 ПДК бензина санитарно-показательные микроорганизмы в воде водоёмов к 6-м суткам теряли способность адекватно отражать степень опасности водоёма по показателю фекального загрязнения.

Для оценки влияния различных концентраций бензина и мазута на качество модельных водоёмов в эксперименте использован показатель Pseudomonas aeruginosa, поскольку в настоящее время этот микроорганизм является дополнительным индикаторным показателем при оценке безо-пасности питьевой воды и воды водных объектов согласно СанПиН 1.2.3685–21¹ и основным микробиологическим показателем согласно ТР ЕАЭС 044/2017 «О безопасности упакованной питьевой воды, включая природную минеральную воду»².

Способность Pseudomonas aeruginosa использовать для своего метаболизма углеводороды приводила к сохранению жизнедеятельности и стимулированию роста клеток в воде водоёмов, содержащих нефтепродукты. По данным О.А. Гоголева и Н.В. Немцева [10], у бактерий Pseudomonas гидрофильная клеточная стенка бедна липидами, и гидрофобные углеводороды не могут проникнуть через этот барьер. Выделяя во внешнюю среду биоэмульгатор, эти микроорганизмы снижают гидрофобность углеводородов и способствуют их солюбилизации. Эмульгатор Pseudomonas представляет собой пептидогликолипид, в состав которого входят нормальные жирные кислоты, рамноза и аминокислоты [10].

Достоверное увеличение биомассы бактерий Pseudomonas aeruginosa находилось в зависимости от концентрации неф-тепродуктов и времени экспозиции. Количество клеток Pseudomonas аeruginosa обнаружено в бόльшем количестве в воде водоёмов с распределением мазута на поверхности в виде плёнки, чем в водоёмах с водомазутной эмульсией. Увеличение содержания в водном объекте Pseudomonas aeruginosa, показателя, обладающего высоким антагонистическим потенциалом, создаёт методические трудности в определении других индикаторных микроорганизмов безопасности воды. Накопление Pseudomonas aeruginosa в водном объекте, содержащем нефтепродукты, повышает опасность водоёма для хозяйственно-питьевого и культурно-бытового водопользования, может увеличивать потенциальный риск для здоровья человека.

Заключение

При значительной концентрации нефтепродуктов в водном объекте при аварийных ситуациях, сбросе недостаточно очищенных сточных вод нефтеперерабатывающих предприятий контроль безопасности воды водоёмов целесообразно проводить, ориентируясь на санитарно-показательные микроорганизмы E. сoli и Е. faecalis. При длительном поступлении в воду водоёмов высоких концентраций нефтепродуктов мониторинг безопасности следует вести по формированию углеводородокисляющих бактерий, в том числе Pseudomonas aeruginosa.

Увеличение содержания в водном объекте Pseudomonas aeruginosa, показателя, который обладает высоким антагонистическим потенциалом, создаёт методические трудности в определении других индикаторных микроорганизмов – показателей безопасности воды.

Сложившаяся ситуация указывает на необходимость разработки унифицированной системы оценки качества и безопасности водных объектов, учитывающей региональную специфику загрязнения нефтепродуктами, что позволит получить полноценную характеристику санитарного состояния объектов с целью определения характера и объёма краткосрочных и долгосрочных профилактических мероприятий по оздоровлению среды обитания и снижению риска заболеваемости населения ОКИ.

¹СанПиН 1.2.3685–21 «Гигиенические нормативы и требования к обеспечению безопасности и (или) безвредности для человека факторов среды обитания», утверждённые постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 28.01.2021 г. № 2 (зарегистрированы Минюстом России 29.01.2021 г., регистрационный № 62296), с изменениями.

²Технический регламент Евразийского экономического союза «О безопасности упакованной питьевой воды, включая природную минеральную воду» (ТР ЕАЭС 044/2017) (с изменениями на 5 октября 2021 г.). Принят Решением Совета Евразийской экономической комиссии от 23 июня 2017 г. № 45.