Сравнительная характеристика острой токсичности гадолиний-содержащих препаратов для МРТ-диагностики

Введение

Магнитно-резонансная томография благодаря своим уникальным возможностям занимает лидирующие позиции в диагностике и соответствует принципам доказательной медицины¹. Одно из главных преимуществ МРТ перед другими методами визуализации, например, компьютерной томографией, – отсутствие ионизирующего излучения. Это делает метод безопаснее для пациентов, позволяет проводить исследования многократно без риска накопления радиационной дозы. Применение магнитоконтрастных препаратов при МРТ значительно повышает качество получаемых изображений, увеличивает чувствительность и специфичность диагностики. В основе контрастной МРТ-диагностики лежит сокращение времени ядерной магнитной релаксации протонов воды за счёт локального усиления растворённым магнитным контрастом накладываемого внешнего магнитного поля. В результате введения контрастного вещества на МРТ-изображениях соответствующие участки приобретают повышенную яркость. Это даёт возможность с высокой точностью визуализировать сосуды, опухоли и другие структуры [1]. Парамагнитные контрастные препараты, ускоряющие Т1-релаксацию, обычно относят к «позитивным» [2]. В МРТ применяется широкий спектр контрастных веществ, разработанных для различных целей. Внеклеточные контрастные вещества играют ключевую роль в выявлении ранних (доклинических) нарушений кровотока в органах. Они позволяют обнаружить патологические изменения задолго до появления каких-либо симптомов. Для получения полной картины этих изменений проводятся многофазные МРТ-исследования, которые включают в себя получение серии снимков в разное время после введения контрастного вещества. Таким образом, МРТ с контрастным усилением является мощным инструментом диагностики, позволяющим визуализировать анатомические структуры с высокой степенью детализации и выявлять патологические изменения на ранних стадиях. Благодаря отсутствию вредного излучения и высокой информативности МРТ с контрастом стала «золотым стандартом» неинвазивной визуализации для широкого спектра болезней, играет ключевую роль в современных системах диспансеризации и позволяет своевременно выявлять и лечить множество патологий. Многофазные исследования с использованием контрастных веществ открывают дополнительные возможности оценки функционального состояния органов и тканей, значительно повышая точность диагностики и эффективность лечения. Постоянное совершенствование методов МРТ и разработка новых контрастных веществ обеспечивают дальнейшее расширение её диагностических возможностей. К контрастным препаратам предъявляют множество требований, среди которых специфическое биораспределение в органах или тканях; быстрое выведение из организма для предотвращения возможной хронической токсичности; низкая токсичность как общепринятый критерий агентов диагностического значения.

Классическим представителем позитивных внеклеточных современных магнитно-резонансных соединений являются низкомолекулярные соединения гадолиния: Gd-DTPA (гадопентетат, Magnevist), Gd-DOTA (гадотерат, Dotarem), Gd-HP-DO3A (гадоттеридол, ProHance) и Gd-DTPA-BMA (гадодиамид, Omniscan) [3, 4]. В настоящее время магнитоконтрастные соединения гадолиния, получившие одобрение FDA (Food and Drug Administration), рекомендуются для использования в МРТ для пациентов со всеми типами рака². В то же время была выявлена взаимосвязь этих соединений с развитием нефрогенного системного фиброза – крайне опасного прогрессирующего поражения почек [5, 6]. В зарубежной практике были отмечены случаи развития анафилактоидных реакций, острой почечной недостаточности, энцефалопатии и панкреатита при использовании гадолиний-содержащих рентгеноконтрастных веществ в макроформе [7–9].

С учётом вышеизложенного в настоящее время проводятся комплексные исследования, направленные на улучшение качества и эффективности МРТ-диагностики, разработку новых кандидатов МР-контраста, методик и методов обработки данных с особым акцентом на отсутствие токсичности препаратов и минимизацию погрешностей (артефактов) в получаемых изображениях. Разработка новых контрастных веществ и методов магнитно-резонансной томографии позволит существенно повысить точность диагностики и уменьшить риск нежелательных последствий для пациентов.

Для повышения эффективности методов контрастирования перспективно применение гадолиния в нанодисперсной форме, стабилизированной высокомолекулярными соединениями, в том числе арабиногалактаном (АГ) лиственницы сибирской [10]. Как показали в своих исследованиях Trofimov B.A. и соавт. (2003), арабиногалактан представляет собой биоактивное соединение с многосторонними фармакологическими свойствами, в том числе гастропротекторным, иммуномодулирующим, мембранотропным и антиоксидантным действием, демонстрируя при этом превосходство над многими синтетическими полимерами [11]. Инкапсулирование наночастиц гадолиния в матрице арабиногалактана (GD-АГ) обеспечивает повышение биодоступности и снижение потенциальной токсичности [12]. Это позволяет предположить возможность применения сниженных доз контрастного агента при эквивалентной эффективности, что потенциально уменьшает токсическую нагрузку и может способствовать улучшению дифференциации границ патологических очагов.

С учётом вышесказанного целью наших исследований была сравнительная характеристика токсичных свойств коммерческого контрастного препарата гадодиамида и наночастиц гадолиния, инкапсулированных в полимерную природную матрицу арабиногалактана.

Материалы и методы

Сравнительное исследование параметров острой токсичности, видовой и половой чувствительности к нанокомпозиту GD-АГ и гадодиамиду (препарат сравнения) проведено при внутрижелудочном введении аутбредным крысам обоего пола массой тела 180–240 г (n = 36). Самки не были беременными или рожавшими. Дополнительно оценку острой токсичности для инновационного препарата (GD-АГ) выполняли при внутрибрюшинном введении белым мышам массой тела 21–32 г (n = 48). Животные случайным образом были разделены на группы по 6 особей одного пола. В качестве критерия приемлемости рандомизации считали отсутствие внешних признаков болезней и гомогенность групп по массе тела (± 20%). При внутрижелудочном введении нативный коммерческий препарат гадодиамид и исследуемый нанокомпозит в виде водной суспензии вводили белым крысам атравматичным зондом в дозе 2000 мг/кг массы тела (м.т.), дозируя путём изменения вводимого объёма раствора при его постоянной концентрации³. Дозы готовили непосредственно перед введением. Контрольные животные внутрижелудочно получали эквивалентный объём дистиллированной воды.

Исследование параметров острой токсичности GD-АГ при внутрибрюшинном введении проводили на аутбредных здоровых половозрелых белых мышах-самках одного возраста и мышах-самцах с использованием стерильных одноразовых шприцев и игл (0,6 × 25). Белым мышам однократно внутрибрюшинно медленно вводили свежеприготовленный раствор нанокомпозита GD-АГ в 0,9%-м растворе NaCl в дозе 2000 и 300 мг/кг м.т. в объёме 0,5 мл на 20 г м.т. Из-за отсутствия информации о токсических эффектах GD-АГ в доступных источниках была выбрана первоначальная предельная доза 2000 мг/кг м.т. В контрольных группах самки и самцы получали в аналогичных условиях и в эквивалентных количествах физиологический раствор. Последующая доза нанокомпозита GD-АГ, введённая шести белым мышам-самкам и шести мышам-самцам, составляла 300 мг/кг м.т. Белые мыши двух разнополых контрольных групп (n = 12) внутрибрюшинно получали 0,5 мл физиологического раствора.

Кормление животных осуществляли через три часа после введения испытуемых веществ. Наблюдение за животными проводили ежедневно в течение 14 дней, особое внимание уделяли первым четырём часам после введения испытуемой дозы. Интоксикацию животных оценивали по следующим показателям: состояние кожных покровов и слизистых оболочек, двигательная активность, диарея, стереотипные движения, положение на боку, саливация, отказ от пищи [13].

В течение эксперимента измеряли массу тела животных и суточное потребление воды (до введения, на 7-й и 14-й дни). Затем животных умерщвляли методом декапитации под лёгким эфирным наркозом и проводили макроскопический анализ внутренних органов. Патоморфологическое исследование включало визуальную оценку органов грудной и брюшной полости, головного мозга [14].

Все экспериментальные животные получены путём собственного воспроизводства в виварии ФГБНУ ВСИМЭИ и содержались на стандартном рационе (BioPrо, Россия), вода – ad libitum. Животных содержали при цикле «света – темнота» 12/12 на вентилируемой полке в условиях контролируемой температуры (плюс 22–25 °C) и влажности 55–60%. Воздухообмен поддерживался с помощью приточно-вытяжной вентиляции, стерилизация воздуха осуществлялась ежедневно путём кварцевания.

Работа выполнена в соответствии с общепринятыми нормами обращения с животными на основе стандартных операционных процедур, принятых в ФГБНУ ВСИМЭИ и протоколом экспериментальных исследований, а также принципами, изложенными в Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях ETS № 123, ГОСТ 33215–2014 «Руководство по содержанию и уходу за лабораторными животными. Правила оборудования помещений и организации процедур», Recommendations for euthanasia of experimental animals: Part 1, Part 2. На проведение исследований получено разрешение Локального этического комитета (протокол № 8 от 15.12.2023 г.). Опытные и контрольные группы подбирались в соответствии с методическими рекомендациями МР 1.2.2566–09⁴.

В эксперименте использовали в качестве полимерной матрицы, стабилизирующей наночастицы гадолиния, природный полисахарид арабиногалактан [10, 15, 16]. Cканирующим микроскопом ТМ 3000 (Хитачи, Япония) с рентгеновским энергодисперсионным микроанализом было определено содержание гадолиния (8,5%). Электронная микроскопия для определения распределения частиц по размерам осуществлялась на просвечивающем электронном микроскопе Leo 906 E (Zeiss, Германия), размеры металлокомплексных наночастиц составляли 1–72 нм. Форма наночастиц и макромолекулы нанокомпозита – сферическая. Гадодиамид (торговое название «Мирадоскан») представляет собой раствор для внутривенного введения 0,5 ммоль/мл (производитель ООО «Фармасинтез-Тюмень», Россия).

Статистическую обработку результатов проводили с помощью программы Statistica 6.1 (StatSoft, СШA, лиц. № AXXR004E642326FA). Результаты были представлены в виде средних арифметических и их стандартных ошибок. Нулевые гипотезы об отсутствии различий между группами отвергали при достигнутом уровне значимости р ≤ 0,05.

Результаты

Исследование острой токсичности гадодиамида и нанокомпозита Gd-АГ (в соответствии с ГОСТ 32644–2014) на крысах показало, что LD₅₀ обоих веществ составляет > 2000 мг/кг м.т. Введение препаратов в данной дозе не привело к гибели ни одного животного обоего пола в течение периода наблюдения. Наблюдаемые признаки токсичности были схожими для обоих препаратов: транзиторное снижение активности, вялость и снижение чувствительности к звуковым стимулам в первые часы после введения. Однако уже через сутки эти симптомы исчезли. В дальнейшем животные оставались активными, без видимых отклонений в дыхании, сердечно-сосудистой деятельности, состоянии шерсти, кожи и слизистых оболочек, что свидетельствует об отсутствии внешних признаков интоксикации. Масса тела у животных всех групп в течение 14 дней наблюдения равномерно увеличивалась (табл. 1).

При макроскопическом исследовании внутренних органов животных, умерщвлённых через 14 дней наблюдения, не было выявлено независимо от введённого препарата существенных различий между экспериментальными группами (основная, сравнения) и контрольной группой. Внутренние паренхиматозные органы (печень, почки, селезёнка) располагались нормально, не имели видимых изменений. Лёгкие бледно-розового цвета, без очагов кровоизлияний. Желудок и кишечник без вздутия, заполнены содержимым. Щитовидная и поджелудочная железы не имели изменений. Оболочки головного мозга обычного цвета, видимых изменений не обнаружено.

В связи с отсутствием смертности и явных признаков сильной интоксикации у животных дальнейшие исследования с более низкими дозами признаны нецелесообразными. Это позволяет заключить, что при однократном внутрижелудочном введении нанокомпозит Gd-АГ и гадодиамид относятся к веществам с низкой опасностью острой токсичности (V класс опасности, DL50 > 2000 мг/кг м.т.).

При введении Gd-Аг внутрибрюшинно в дозе 2000 мг/кг м.т. наблюдалась 100%-я смерть белых мышей обоих полов в первые сутки поступления вещества. Уже через 3–5 мин у животных было выражено снижение двигательной активности. Мыши лежали на боку, дыхание становилось неравномерным, редким и судорожным. У отдельных особей наблюдали тремор и тонико-клонические судороги, скребущие движения передними лапками. Вскрытие умерших животных выявило множественные кровоизлияния в лёгких, печени, селезёнке, оболочках головного мозга, а также вздутие желудка и кишечника. При введении нанокомпозита в дозе 300 мг/кг м.т. все самки и самцы белых мышей выжили. В первые минуты наблюдалось снижение двигательной активности, мыши замирали, сбивались в кучку. Изменения частоты дыхания не отмечалось. На следующие сутки животные выглядели обычно, не отличаясь поведением и внешним видом от контрольных животных. В отдельных случаях шерсть имела неопрятный вид. При внутрибрюшинном введении мышам нанопрепарата также наблюдали прирост массы тела, однако у контрольных животных масса тела в среднем увеличилась на 2,2 г, а в группе, получившей Gd-АГ, прибавка составила всего 0,9 г (табл. 2).

Макроскопическое исследование внутренних органов животных, подвергшихся эвтаназии на 14-е сутки после введения исследуемого вещества, не выявило патоморфологических изменений. Внешний вид животных соответствовал норме, телосложение было конституционально правильным. Слизистые оболочки имели физиологическую окраску, гладкую поверхность и выраженный блеск. Сердце и сосуды не демонстрировали отклонений от нормы по размеру, форме и структуре. Просвет трахеи и бронхов был свободен, обтурация и стеноз отсутствовали. Лёгкие имели нормальную консистенцию, размер и цвет (бледно-розовый), однородную поверхность. Пищевод не имел признаков стеноза или обтурации, слизистая оболочка была интактной. Органы брюшной полости: желудок, печень, селезёнка и поджелудочная железа покрыты соединительнотканной оболочкой и спаяны в один комок, припаяны к стенке брюшной полости. При этом сами органы не имели видимых изменений. Желудок обычного размера и окраски, скорость эвакуации пищи из желудка соответствует норме. Печень обычного размера и окраски, нормальной консистенции, кровенаполнение органа умеренное. Поджелудочная железа нормального размера, окраски и консистенции. Размер, окраска и плотность селезёнки также в пределах нормы. Кишечник обычной окраски. Кольца кишечника спаяны со стенкой брюшной полости. Исследование показало, что почки находятся в пределах нормы по размеру и имеют типичный коричневый цвет. Корковое и мозговое вещество на срезе чётко разграничены. Надпочечники также в норме: круглые, беловатые, умеренной плотности. Мочевой пузырь не увеличен, функция опорожнения нормальная, а слизистая оболочка гладкая и блестящая. Цвет, форма и окраска семенников в норме. Матка обычного размера и окраски. Яичники нормального размера, красноватого цвета, умеренной плотности. Оболочки головного мозга блестящие, тонкие и гладкие, расширения желудочков на фронтальном срезе не отмечено.

Среднесмертельная доза при внутрибрюшинном введении мышам нанокомпозита Gd-АГ находится в интервале 300 мг/кг м.т. < ЛД₅₀ < 2000 мг/кг м.т., что соответствует IV классу острой токсичности (малотоксичное вещество) согласно классификации К.К. Сидорова⁵.

По эмпирической формуле (1) получаем расчётную величину DL₅₀ при внутрибрюшинном введении (для крыс ≈ 400 мг/кг м.т.)⁶, которая также соответствует IV классу острой токсичности (малотоксичное вещество) по классификации К.К. Сидорова:

lgDL₅₀ в/бр = 0,89 lgDL₅₀ в/жел – 0,13,         (1)

где DL₅₀ в/жел = 2000 мг/кг м.т.

Таким образом, полученные результаты изучения токсичности препарата, содержащего наночастицы Аг-Gd, свидетельствуют о слабовыраженных токсичных свойствах при внутрибрюшинном введении нанокомпозита как мышам, так и крысам.

Обсуждение

Создание новых эффективных магнитоконтрастных соединений для МРТ-диагностики – важное направление исследований. К основным параметрам диагностических препаратов относится отсутствие токсичности для организма. Гадолиний-содержащие препараты, используемые в клинических исследованиях, к сожалению, приводят в некоторых случаях к развитию нежелательных эффектов. Основными факторами, определяющими токсичность свободного Gd³⁺, являются его плохая растворимость в физиологических условиях, приводящая к замедленному выведению из организма, способность замещать ионы кальция, вызывать окислительный стресс, нарушая нормальные физиологические процессы [17–21]. С учётом этих обстоятельств перспективно применение в МРТ-исследованиях наноформ гадолиния, что снизит поступающую в организм дозу вещества при равной эффективности. Одним из основных показателей токсичности химических соединений и лекарственных препаратов являются значения среднесмертельных доз, позволяющих оценить класс опасности изучаемых веществ.

В настоящем исследовании проведена сравнительная оценка показателей острой токсичности коммерческого препарата гадодиамида, широко применяемого при МРТ-исследованиях, и инновационного препарата наногадолиния, стабилизированного природным полимером арабиногалактаном. Анализ полученных результатов показал, что по параметру DL₅₀ при однократном внутрижелудочном введении нанокомпозит Gd-АГ имеет низкую острую токсичность и относится к V классу опасности (DL₅₀ > 2000 мг/кг м.т.). Среднесмертельная доза (DL₅₀) при внутрижелудочном введении независимо от пола животных определена на уровне > 2000 мг/кг м.т., что свидетельствовало об отсутствии различий в половой чувствительности животных.

Вместе с тем отмечена несколько повышенная видовая чувствительность белых мышей обоего пола при внутрибрюшинном введении нанокомпозита Gd-АГ. Среднесмертельная доза при внутрибрюшинном введении нанокомпозита Gd-АГ находится в интервале 300 мг/кг м.т. < ЛД₅₀ < 2000 мг/кг м.т., что соответствует IV классу острой токсичности по классификации К.К. Сидорова и характеризует вещество как малотоксичное. Следует отметить, что при внутрибрюшинном введении нанокомпозит Gd-АГ вызывает гибель животных при дозе 2000 мг/кг м.т., чего не наблюдалось при введении 300 мг/кг м.т.. Однако у выживших животных были выявлены нарушения внутренних органов при макроскопическом исследовании. Это вызывает определённую насторожённость, которую следует учитывать при внутривенном введении препарата. В то же время эти изменения наблюдались при введении высокой дозы нанопрепарата, тогда как эквивалентная доза нанокомпозита установлена расчётным путём на уровне 4–6 мг/кг м.т., то есть в 50–75 раз меньше.

Определение среднесмертельной дозы гадодиамида (препарата сравнения) в дозе 2000 мг/кг при внутрижелудочном введении контрольным животным и крысам основной группы, получившим нанопрепарат, показало отсутствие гибели и макроскопических изменений внутренних органов у крыс обоего пола. Следовательно, при однократном внутрижелудочном поступлении гадодиамид также характеризуется как вещество, имеющее низкую опасность острой токсичности и относящееся к V классу опасности (DL₅₀ > 2000 мг/кг м.т.). Во всех трёх группах наблюдался положительный баланс прироста массы тела.

Заключение

По токсикометрическим параметрам острой токсичности среднесмертельные дозы (DL₅₀) при внутрижелудочном введении крысам коммерческого препарата гадодиамида и инновационного нанокомпозита Gd-АГ одинаковы (> 2000 мг/кг), что характеризует данные вещества как имеющие низкую опасность острой токсичности (V класс опасности). Данный показатель не имеет гендерных отличий. Среднесмертельная доза при внутрибрюшинном введении нанокомпозита Gd-АГ находится в интервале 300 мг/кг м.т. < ЛД₅₀ < 2000 мг/кг м.т., что соответствует IV классу острой токсичности по классификации К.К. Сидорова и характеризует вещество как имеющее малую токсичность.

¹ Об утверждении порядка проведения диспансерного наблюдения за взрослыми: Приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации от 15.03.2022 г. № 168н, Регистрационный № 68288 от 21.04.2022 г.

² FDA Drug Safety Communication: FDA evaluating the risk of brain deposits with repeated use of gadolinium-based contrast agents for magnetic resonance imaging (MRI). https://www.fda.gov/Drugs/DrugSafety/ucm559007.htm (дата обращения: 09.06.2025 г.)

³ ГОСТ 32644–2014. Методы испытания по воздействию химической продукции на организм человека. Острая пероральная токсичность – метод определения класса острой токсичности [Текст]. Введ. 2015–06–01. М.: Стандартинформ, 2015. 17 с.

⁴ МР 1.2.2566–09 Оценка безопасности наноматериалов in vitro и в модельных системах in vivo. М., 2009.

⁵ Методические указания МУ 1.2.1105–02 «Оценка токсичности и опасности дезинфицирующих средств» (утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 10 февраля 2002 г.). Приложение 3. Классификация токсичности веществ при введении под кожу и в брюшную полость животного (по К.К. Сидорову).

⁶ Гигиеническое нормирование лекарственных средств в воздухе рабочей зоны, атмосферном воздухе населённых мест и воде водных объектов. Методические указания. МУ 1.1.726–98.