Влияние in vitro электромагнитного излучения мобильного телефона на антиген-специфическую активность Т-лимфоцитов крови у людей, перенёсших COVID-19

Введение

Актуальность оценки влияния электромагнитного излучения (ЭМИ) на функции биологических систем не снижается, несмотря на санитарно-эпидемиологические требования, предъявляемые к бытовым приборам, офисной технике и др. Причина заключается в широком и постоянно возрастающем внедрении техногенных источников ЭМИ в жилые помещения [1].

Иммунная система относится к числу объектов, наиболее чувствительных к воздействию ЭМИ. Исследованиям характера и интенсивности этого влияния посвящены обзоры [2, 3] и оригинальные статьи [4–8]. Однако мнение о том, что влияние ЭМИ радиочастотного диапазона на клетки, ткани и системы живых организмов отчётливо и существенно, не является общепринятым [5, 9].

Ранее нами была разработана экспериментальная модель, на базе которой проведена количественная оценка влияния ЭМИ мобильного телефона на фагоцитарную активность нейтрофилов человека [10] и на активацию лимфоцитов митогенами in vitro [11]. При этом существует ещё один важный аспект функционирования иммунной системы – активность Т-клеток иммунной памяти. Эти клетки играют наиболее значительную роль в защите организма от вирусных инфекций, но методы их исследования, трудоёмкие и дорогостоящие [12–14], ограничивают экспериментальную оценку воздействия ЭМИ и других физических факторов на антиген-специфические Т-лимфоциты.

Цель исследования заключалась в применении собственного запатентованного способа определения специфического клеточного иммунного ответа на антигены коронавируса (SARS-COV-2) [15] для оценки in vitro влияния ЭМИ мобильного телефона на Т-клетки памяти против SARS-CoV-2 у лиц, перенёсших COVID-19.

Материалы и методы

Испытуемое оборудование – мобильный телефон с параметрами SAR на тело 1,18 Вт/кг, SAR на голову 1,25 Вт/кг; в телефоне активировали максимально возможное количество функций (bluetooth, Wi-Fi). Объектом исследований служили образцы крови 46 людей, перенёсших COVID-19 (22 человека болели в период с ноября 2020 г. по июль 2021 г., 24 перенесли болезнь в лёгкой либо среднетяжёлой форме в период с декабря 2022 г. по март 2023 г.). Диагностика COVID-19 и терапия пациентов проводились в поликлиниках и клиниках Москвы. Все доноры дали информированное согласие на участие в исследовании, одобренном Этическим комитетом ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского (протокол № 41 от 10.12.2020 г.). Переболевшие COVID-19 обследовались через 1–1,5 мес после перенесённой болезни.

Выделенные из гепаринизированной венозной крови человека мононуклеарные клетки, содержащие 85–95% лимфоцитов, вносили в лунку в рабочей концентрации 2,5 ∙ 10⁶/мл и инкубировали при температуре плюс 37 °С и 5% СО₂ в течение 20 ч. Для антигенной стимуляции (АГ-стимуляции) использовали полистироловые планшеты из наборов, предназначенных для ИФА-обнаружения антител к SARS-CoV-2 (SARS-CoV-2-IgG-ИФА-БЕСТ (АО «Вектор-Бест», Россия), или ИФА-набор для выявления IgG-антител к цельновирионному инактивированному SARS-CoV-2 (ФБУН ГНЦ «Вектор», РЗН № 2020/10017 от 10.04.2020 г.)). Митогенную стимуляцию проводили внесением в лунку 20 мкл фитогемагглютинина P в рабочей концентрации. Процедура стимуляции подробно описана в статье [16]. В контрольной пробе мононуклеары инкубировались без антигена.

Для оценки влияния ЭМИ мобильного телефона каждый образец клеток (интактный или АГ-стимулированный) делили на две порции. Одну порцию инкубировали в течение четырёх часов при воздействии ЭМИ мобильного телефона, вторую – без него. Культуральные планшеты находились в разных термостатах в двух разных комнатах. На телефон выполняли звонки каждые 10 мин в течение 4 ч (всего 25 звонков), при этом динамики и вибрация были отключены. Через 4 ч телефон убирали, общая продолжительность инкубации планшетов в термостате составляла 20 ч. По окончании периода антигенной стимуляции из лунок отбирали надосадочную жидкость, в которой определяли концентрацию интерферона-гамма (IFN-γ) и её изменение по сравнению с пробой без антигена.

Наличие в крови обследуемого Т-клеток памяти, способных распознавать антиген SARS-CoV-2 и активироваться в его присутствии, определялось повышением концентрации IFN-γ после АГ-стимуляции культуры выделенных клеток.

Статистический анализ результатов исследования выполнен с помощью программ Microsoft^® Office Excel и GraphPad Prism 8. Достоверность различий оценивали с помощью непараметрического U-критерия Манна – Уитни для независимых выборок.

Результаты

Влияние ЭМИ мобильного телефона на активность Т-клеток памяти изучали в различные периоды пандемии COVID-19: в начальный период на территории Российской Федерации (2020–2021 гг.) и в период активной циркуляции омикрон-штамма (2022–2023 гг.).

Регистрацию активации вирус-специфических Т-клеток проводили по увеличению продукции ими IFN-γ, которое запускалось в момент распознавания антигена. Функциональный потенциал общего пула Т-лимфоцитов у тех же доноров оценивали по способности к митоген-индуцированной продукции IFN-γ (для индукции использован фитогемагглютинин Р (ФГА)).

Результаты изучения митоген-индуцированной активности клеток крови по продукции IFN-γ до и после воздействия ЭМИ мобильного телефона представлены в табл. 1, 2.

Результаты измерений показали, что медианные значения концентрации цитокина IFN-γ в супернатантах ФГА-стимулированных выделенных лимфоцитов при воздействии ЭМИ телефона на культуру клеток у людей, перенёсших COVID-19, статистически достоверно ниже, чем в супернатантах ФГА-стимулированных лимфоцитов, не подвергавшихся воздействию ЭМИ мобильного телефона.

Поскольку в разные периоды пандемии циркулировали различные штаммы вируса SARS-CoV-2, при изучении in vitro влияния ЭМИ мобильного телефона на выделенные лимфоциты переболевших людей статистическую обработку результатов на этапах наблюдения проводили отдельно (см. табл. 2).

Как видно из табл. 2, при культивировании лимфоцитов без антигена продукция ими IFN-γ практически не изменялась под воздействием ЭМИ мобильного телефона. Однако в присутствии антигенов вируса SARS-CoV-2 у лиц, перенёсших COVID-19, Т-клетки памяти через 1–1,5 мес после выздоровления распознавали специфический антиген in vitro и отвечали на стимуляцию повышенной продукцией IFN-γ. Экспозиция культурального планшета с мобильным телефоном в течение четырёх часов приводила к торможению активности Т-клеток памяти. Стимулированная антигеном вируса SARS-CoV-2 продукция IFN-γ у некоторых пациентов снижалась до 0.

В образцах супернатантов, собранных в 2020–2021 гг., при стимуляции антигеном медианная продукция IFN-γ в необлучённых пробах составляла 213 (64,3; 816) пг/мл, в то время как в образцах, находившихся под воздействием ЭМИ мобильного телефона, концентрация цитокина была в 3,7 раза ниже. Снижение активности Т-клеток памяти являлось статистически достоверным при р = 0,0498.

Во втором периоде наблюдений (эпидсезон 2022–2023 гг.) стимулированная продукция IFN-γ иммунокомпетентными клетками переболевших людей была несколько ниже, чем у людей, перенёсших COVID-19 в начале пандемии. Однако при стимуляции антигеном образцов, собранных в данный период пандемии, также наблюдали достоверное снижение активности Т-клеток памяти при воздействии ЭМИ мобильного телефона (р = 0,0095).

Таким образом, результаты экспериментов, проведённых в периоды циркуляции различных штаммов вируса SARS-CoV-2, аналогичны. Снижение продукции IFN-γ стимулированными иммунокомпетентными клетками, в данном случае Т-клетками памяти к вирусу SARS-CoV-2, при воздействии ЭМИ мобильного телефона in vitro характеризует ответную реакцию лимфоцитов людей, переболевших COVID-19, независимо от штамма вируса. Воздействие ЭМИ мобильного телефона на выделенные лимфоциты приводит к снижению их специфической функциональной активности в общей сложности на 66,6 ± 11,4%.

Следует отметить, что при усреднении данных теряется значительная часть информации о влиянии ЭМИ на тест-объект: о том, у какого числа людей происходит снижение, а у какого – повышение показателя, а также о частоте слабых и сильных изменений.

В связи с этим мы провели анализ индивидуальной чувствительности АГ-стимулированных Т-клеток памяти к воздействию ЭМИ мобильного телефона in vitro и графически представили результаты на рисунке. Анализ проводили с использованием Δ, которая является разницей между концентрацией IFN-γ в АГ-стимулированной пробе и концентрацией IFN-γ в пробе без антигена [Δ = (IFN-γ АГ – IFN-γ без АГ)]. Кроме того, результаты измерений концентрации цитокина в образцах супернатантов 46 человек разделили на две группы: для пациентов с уровнем АГ-стимулированной продукции IFN-γ выше 200 пг/мл (см. рисунок, А) и уровнем меньшим или равным 200 пг/мл (см. рисунок, B).

Как показал анализ результатов исследования, только у четырёх человек культура выделенных мононуклеаров крови среагировала повышением продукции IFN-γ на воздействие ЭМИ мобильного телефона in vitro. Ещё у трёх людей снижение концентрации IFN-γ в супернатантах с АГ-стимулированными Т-клетками было относительно небольшим – оно составило 8,9–16,6% от исходного показателя АГ-стимулированной продукции.

В ходе отработки применённого нами метода его воспроизводимость характеризовалась коэффициентом вариации CV = 21,2% [16], поэтому три вышеуказанные пробы были расценены нами как нечувствительные к ЭМИ. В остальных образцах под влиянием ЭМИ мобильного телефона снижение продукции IFN-γ превышало 21%.

Обсуждение

Для оценки воздействия ЭМИ мобильного телефона на культуру выделенных мононуклеаров, содержащую Т-клетки памяти к антигенам вируса SARS-CoV-2, выбрана модель облучения, при которой объект получает нагрузку, сравнимую с той, которую человек, пользующийся мобильным телефоном, может получить в течение суток.

Ранее в этой модели нами было показано, что ЭМИ мобильного телефона влияет на способность лимфоцитов продуцировать различные цитокины при их стимуляции митогеном фитогемагглютинин Р у привитых людей [11]. Настоящее исследование подтвердило наличие эффекта ЭМИ мобильного телефона на такую поликлональную активацию Т-лимфоцитов. В ходе работы также получены данные о влиянии ЭМИ мобильного телефона на АГ-специфическую активность Т-клеток памяти. Подобные модели часто применяются в экспериментальных исследованиях.

В работе Yadav H. и Singh R. [18], изучавших влияние неионизирующего ЭМИ мобильных телефонов, отмечено повышение уровня цитокина IL-1α в культуре лейкемических моноцитарных клеток, а также уровня реактивных веществ, таких как оксид азота (NO) и оксид серы (SO), по сравнению с контрольной группой в сочетании со значительным снижением фагоцитарной активности моноцитов. Экспозиция культуральных планшетов в электромагнитном поле выполнялась в режиме: воздействие ЭМИ мобильного телефона с частотой 2318 MHz (MHz) и плотностью поля 0,224 W/m² в течение 15; 30; 45; 60; 90 и 120 мин.

Sieroń K. и соавт. [17] проводили исследования на лабораторных животных и показали, что антиоксидантная активность при оценке влияния электромагнитных полей с различными физическими свойствами проявлялась в снижении активности каталазы в гомогенатах языка, пищевода, желудка, тонкого и толстого кишечника по сравнению с контрольной группой. Для исследования влияния ЭМИ на мобильный телефон Nokia 5110 (с частотой 900 MHz), закреплённый на клетке, совершались звонки, каждый длительностью 15 с, в течение 4 ч утром и 4 ч вечером. Всего выполняли 16 звонков в день. Средняя плотность электромагнитного поля оценивалась как 85,3 µW/m² в момент соединения и как 17 µW/m² при продолжении соединения.

Следовательно, полученные нами результаты согласуются с данными других исследователей и свидетельствуют о влиянии ЭМИ мобильного телефона на общую функциональную активность иммунокомпетентных клеток и на специфические функции Т-клеток памяти, отвечающих за противовирусный иммунный ответ.

Аналитические обзоры доказательности исследований влияния ЭМИ указывают на недостаточную стандартизацию экспериментов и погрешности дозиметрии [5]. Не отрицая важности этих аспектов, считаем, что чувствительность биологических объектов к ЭМИ чаще обнаруживается в экспериментах, где моделируется определённый иммунологический процесс, работа ведётся на клеточных линиях, имеющих опухолевое происхождение, или на клетках больных людей с конкретным диагнозом. В группе здоровых людей, по существу значительно разнородной, однонаправленные изменения в принципе происходят реже.

Ограничение исследования. Влияние ЭМИ мобильного телефона на функциональную активность АГ-специфических Т-клеток против вируса SARS-CoV-2 показано нами in vitro, а не при воздействии ЭМИ на человека. Эти модели имеют существенные различия.

Заключение

Таким образом, выявленный в ходе исследований биологический эффект ЭМИ мобильного телефона, который in vitro выражается в снижении антиген-индуцированной продукции IFN-γ у людей, имеющих Т-клетки памяти против антигенов вируса SARS-CoV-2, может свидетельствовать о снижении функциональной активности лимфоцитов и, как следствие, приводить к ослаблению защиты организма человека в отношении инфекционных болезней.

Полученные данные могут быть важны для гигиенического нормирования ЭМИ радиочастотного диапазона, например, в медицинских стационарах, модернизация инфраструктуры которых в настоящее время является одной из приоритетных государственных программ [19]. Врачам предоставляют планшетные компьютеры, которые посредством беспроводного радиочастотного приёма (передачи) данных позволяют оперативно просмотреть и дополнить любую информацию в электронной медицинской карте, повышают эффективность врачебного обхода пациентов. Для правильного проведения процедур медицинские сёстры пользуются радиочастотной идентификацией больных, беспроводным устройством для мониторинга капельниц, сигнализирующим о завершении процедуры или аномалиях [20, 21]. Отказ от беспроводной связи в пользу проводной во всех случаях, когда это возможно, уменьшит нагрузку на иммунную систему пациентов в инфекционных, ожоговых или хирургических отделениях.