Оценка эффективности биопрофилактики некоторых нейротоксических эффектов ацетата свинца у родителей и потомства крыс

Введение

Развитие производственных мощностей регионов неминуемо сопровождается загрязнением среды обитания вредными веществами, обладающими опасными токсическими эффектами. Некоторые тяжёлые металлы, такие как свинец и его соединения, способны вызывать нарушения здоровья не только у лиц, подвергающихся их воздействию, но и у последующих поколений. Особое внимание необходимо уделить нейротоксическим эффектам свинца. Экспериментальные исследования и клинические наблюдения подтверждают выраженный токсический эффект свинца в отношении центральной нервной системы (ЦНС). Известно, что негативное влияние свинцовых соединений может приводить к различным нейродегенеративным патологиям (энцефалопатия, астеноневротический синдром, умственные расстройства, дизартрия и др.¹) [1, 2]. Одной из ключевых стратегий снижения рисков для здоровья человека стала биологическая профилактика. Исследования по разработке и экспериментальной апробации биопрофилактических комплексов (БПК), компоненты которых способны повышать устойчивость организма к токсическому действию тяжёлых металлов, продемонстрировали высокую эффективность [3, 4]. Однако не установлено, могут ли меры биологической профилактики снижать выраженность отдалённых токсических эффектов у потомства экспонированных лабораторных животных.

Цель работы – оценка эффективности биологической профилактики отдалённых нейротоксических эффектов ацетата свинца у родительского звена крыс, подвергнутых экспозиции в субхроническом эксперименте, и их потомства.

Материалы и методы

Содержание лабораторных животных. Для реализации эксперимента были использованы белые беспородные крысы обоих полов в возрасте четырёх месяцев (филиал «Андреевка» ФГБУН НЦБМТ ФМБА России, 141551, МО, г. Солнечногорск, рп Андреевка, стр. 49. Сертификат № 181164, дата выдачи 09.12.2024 г.). Содержание экспериментальных животных было организовано в условиях вивария в соответствии с санитарными и ветеринарными требованиями. Проведение эксперимента одобрено локальной комиссией по биоэтике ФБУН ЕМНЦ ПОЗРПП Роспотребнадзора (протокол ЛЭК от 03.02.2025 г.). Для снижения влияния негативных зоосоциальных факторов и соблюдения мер гигиены животных содержали в клетках в количестве не более шести особей с разделением по половому признаку. Замена подстила в клетках осуществлялась каждые три дня или чаще при чрезмерном загрязнении. Для проверки текущего состояния лабораторных животных, предотвращения болезней, обеспечения достаточных условий содержания и стандартизации процедур кормления и ухода в рамках подготовки и в течение всего срока эксперимента проводили ежедневный ветеринарный контроль. Крыс кормили гранулированным комбикормом, сбалансированным по показателям пищевой ценности согласно ГОСТ Р 50258–92, поили очищенной питьевой водой, выполняли ежедневное мытьё и замен бутылей. В комнатах содержания экспериментальных животных был смоделирован 12-часовой световой режим день/ночь с имитацией закатов и рассветов с помощью автоматической системы управления искусственным освещением. На протяжении всего эксперимента животные содержались в следующих параметрах микроклимата: температура воздуха – плюс 20–22 °С, относительная влажность – 30–70%.

Экспериментальная модель. В рамках первого этапа родительское звено (F0) экспериментальных лабораторных животных (n = 96) было разделено на четыре группы:

• Контроль – не подвергались воздействию ацетата свинца;
• Pb – воздействие ацетата свинца;
• Pb + БПК – воздействие ацетата свинца на фоне приёма БПК;
• БПК – приём БПК без экспозиции ацетатом свинца.

Экспериментальные группы крыс F0 представлены в табл. 1.

Для моделирования токсического действия химического фактора был приготовлен водный раствор на основе свинца (II) уксуснокислого трёхводного (ЧДА, ГОСТ 1027–67, производство АО «ВЕКТОН», ул. 2-й луч., д. 9А). Лабораторные животные группы Pb и Pb + БПК были подвержены экспозиции ацетатом свинца перорально, ежедневно на протяжении 45 дней. Суточная доза ацетата свинца составила 85,6 мг/кг м. т. По окончании экспозиции крысы были ссажены в течение 7 дней для спаривания (1 самец и 2 самки в клетке). Выведение родительского звена крыс (F0) осуществлялось непосредственно после окончания периода лактации – спустя 21 день после родов. По окончании первого этапа эксперимента у крыс поколения F0 были отобраны образцы крови и изготовлены гомогенизаты молочных желёз для измерения концентрации свинца методом атомно-абсорбционной спектрометрии (ААС Agilent 280Z, производство Agilent Technologies, США). Подготовку проб проводили методом сухого озоления в муфельной печи при температуре плюс 450 °C. Минерализат анализировали в водном растворе соляной кислоты (6%). Обработку результатов проводили в пересчёте на сухое вещество.

В рамках второго этапа по окончании лактации из общего числа родившихся крыс в случайном порядке были выбраны 96 особей для последующего формирования новых групп сравнения (табл. 2).

Выведение лабораторных животных F0 и F1 из эксперимента осуществлялось по окончании периода лактации – спустя 21 день после родов. При этом ни родительское звено, ни потомство в этот период не подвергалось экспозиции ацетатом свинца и не получало БПК. У крыс F0 и F1 были отобраны образцы крови из бедренной артерии для определения концентрации свинца методом масс-спектрометрии с индуктивно связанной аргоновой плазмой согласно МУК 4.1.1483–03² (погрешность измерения 12–20%) и в гомогенизатах молочных желёз методом атомно-абсорбционной спектрометрии (ААС Agilent 280Z, производство Agilent Technologies, США) согласно МУ 42–46–87³ (погрешность измерения 20%). Подготовку проб проводили методом сухого озоления в муфельной печи при температуре плюс 450 °C. Минерализат анализировали в водном растворе соляной кислоты (6%). Обработку результатов проводили в пересчёте на сухое вещество. У обоих поколений оценивали когнитивные функции с помощью поведенческих тестов «Открытое поле с норками», «Крестообразный лабиринт» согласно МР 1.2.0382–25⁴. Схема дизайна эксперимента представлена на рис. 1.

Состав и дозировки биопрофилактического комплекса. Биопрофилактический комплекс вводили с кормом, расчёт доз витаминов и минералов проводили с учётом их физиологической нормы для крыс, принимая во внимание предположительно повышенный расход витаминов-антиоксидантов на фоне токсического действия ацетата свинца. Учитывали также витамины и минеральные вещества, входящие в состав корма. Состав, способ введения и дозировка препаратов БПК приведены в табл. 3.

Статистический анализ. Нормальность распределения данных оценивали с помощью критерия Шапиро – Уилка. Статистический анализ проведён с использованием t-критерия Стьюдента и U-критерия Манна – Уитни с поправкой на множественные сравнения. Различия считали статистически достоверными, если вероятность различия не превышала 5% (р < 0,05). Результаты на столбчатых диаграммах представлены в виде среднегрупповых значений, доверительные интервалы – в виде вертикальных усов.

Результаты

Оценка содержания свинца в крови крыс F0 и F1, молочных железах самок F0. Результаты анализа цельной крови свидетельствуют о существенном увеличении концентрации свинца в группе Pb родительского звена (F0) по сравнению с контролем (p < 0,05). В группе Pb + БПК также наблюдалось значимое повышение этого показателя, однако изменения были менее выражены по сравнению с группой Pb (p < 0,05). Эти данные соотносятся с результатами оценки концентрации свинца в крови потомства лабораторных животных. У потомства (F1) группы Pb отмечены более высокие уровни свинца в крови (в 2 раза) по сравнению с контролем (p < 0,05). Вместе с тем у крыс F1 группы Pb + БПК этот показатель был в 1,5 раза ниже, чем в группе Pb (p < 0,05). Концентрация свинца у крыс F1 группы БПК поколений F0 и F1 находились на уровне контрольных значений (рис. 2).

Выявлено значимое увеличение содержания свинца в гомогенизатах молочных желёз самок F0, получавших ацетат свинца, в 4,32 раза (p < 0,05) по сравнению с контролем. На фоне приёма БПК у экспонированных самок также наблюдалось увеличение концентрации свинца в молочных железах по сравнению с контрольными значениями (p < 0,05), однако оно было менее выраженным, чем у группы Pb (p < 0,05). Содержание свинца в молочных железах крыс, получавших БПК без экспозиции ацетатом свинца, находилось на уровне контрольных значений (рис. 3).

Результаты оценки поведенческих реакций. У крыс F0, получавших ацетат свинца, наблюдались изменения поведенческих реакций в тесте «Открытое поле с норками»: уменьшение количества пересечённых квадратов в 2,07 раза (p < 0,05) и количества заглядываний в норки в 1,44 раза (p < 0,05) по сравнению с контрольными значениями. В группе Pb + БПК число пересечённых квадратов было больше (в 1,87 раза; p < 0,05), как и число заглядываний в норки (в 1,18 раза; p > 0,05) по сравнению с группой Pb. Группа БПК не имела значимых различий с контролем. У потомства экспериментальных лабораторных животных, получавших ацетат свинца, была выявлена тенденция изменения в поведении, несмотря на отсутствие прямой экспозиции, однако эти изменения носили менее выраженный характер. Так, у потомства крыс (F1), экспонированных ацетатом свинца, наблюдалось снижение количества пересечённых квадратов в 1,22 раза (p > 0,05) и числа заглядываний в норки в 1,26 раза (p > 0,05) по сравнению с контрольной группой (рис. 4).

Иные результаты получены при анализе данных двигательной активности крыс в тесте «Приподнятый крестообразный лабиринт». Несмотря на отсутствие значимых различий между группами F0 по общей пройденной дистанции, у потомства группы Pb наблюдалось выраженное снижение этого показателя в 1,84 раза (p < 0,05) по сравнению с контролем. При этом у потомства групп Pb + БПК и БПК пройденные дистанции соответствовали контрольным значениям (рис. 5).

У потомства группы Pb наблюдалось не только снижение двигательной активности и когнитивных функций, но увеличение числа актов замирания в 1,33 раза (p < 0,05) и длительности пребывания в отрытых рукавах в 2 раза (p < 0,05) по сравнению с контролем. При этом потомство группы Pb + БПК и БПК продемонстрировало близкие к контрольным значения этих показателей (рис. 6).

Обсуждение

Высокая концентрация свинца в крови потомства крыс, подверженных экспозиции, связана с поступлением его через грудное молоко во время кормления в лактационном периоде, а также, вероятно, с накоплением плодом во время беременности. При этом снижение концентрации свинца в молочных железах родительского звена крыс, получавших биологическую профилактику на фоне экспозиции, связано с элиминационными свойствами компонентов БПК. Так, пектин, обладающий способностью образовывать с тяжёлыми металлами нерастворимые хелатные комплексы [5], препятствует как первичному всасыванию свинца в кровь через ЖКТ, так и его реабсорбции в кишечнике, что особенно важно при пероральном пути экспозиции. Этот механизм, вероятно, тормозил накопление свинца в организме лабораторных животных, в том числе и депонирование в молочных железах, что существенно снизило риски для здоровья потомства. Более низкие концентрации свинца в крови потомства лабораторных животных, получавших БПК на фоне экспозиции, очевидно, сыграли одну из ключевых ролей в выраженности наблюдаемых токсических эффектов.

Наиболее опасно воздействие свинца в периоды подготовки к беременности, активного эмбрионального развития и раннего детского возраста, в котором происходит созревание органов и систем организма. Сравнительный анализ демонстрирует неоднородный характер наблюдаемых изменений поведенческих реакций у крыс F0 и F1. Если у родительского звена группы Pb по результатам теста «Открытое поле с норками» в большей степени наблюдалось снижение когнитивной функции и исследовательской активности, то у потомства этих животных преобладали признаки дезадаптации и дезориентации, обусловленные тормозными процессами в ЦНС. В частности, высокое количество актов замирания, наблюдаемое у потомства крыс, получавших ацетат свинца, является типичной адаптивной реакцией грызунов на новые внешние стимулы, представляющие потенциальную опасность.

С учётом идентичных условий тестирования экспериментальных животных и отсутствия каких-либо значимых внешних стимулов, исходящих от исследователя и (или) оборудования, такие изменения могут говорить о повышенном уровне тревожности крыс и их неспособности быстро и соразмерно оценивать обстановку для принятия адекватного решения. Длительное пребывание в открытых рукавах крестообразного лабиринта может рассматриваться как исследовательская активность и стремление изучить окружение, однако патологическое повышение этого показателя у крыс F1 из группы Pb и длительное бездействие, наблюдаемое в данном тесте, указывает на торможение ЦНС. В таком случае увеличение времени нахождения в открытых рукавах в сочетании с большим количеством актов замирания и существенным снижением общей пройденной дистанции может свидетельствовать о дезориентации и пространственной дезадаптации.

Наблюдаемые нейротоксические эффекты, вероятно, связаны с накоплением активных форм кислорода (АФК) и последующей гибелью клеток на фоне окислительного стресса, индуцированного токсическим действием ацетата свинца [6] на плод в период беременности и при грудном вскармливании. В патогенезе токсического действия свинца на головной мозг существенную роль может играть перекисное окисление липидов (ПОЛ) мембран клеток [7]. Вероятно, антиоксидантные свойства витаминов А, Е и С [8–11] позволили снизить активность ПОЛ, что положительно сказалось на результатах крыс F0 группы Pb + БПК. Тем не менее мы предполагаем, что у потомства этих крыс протекторный эффект также был связан с более эффективной элиминацией свинца из организма родителей, следовательно, со снижением интенсивности непрямого воздействия токсиканта через гематоплацентарный барьер и грудное молоко. Определённую роль в обеспечении здоровья ЦНС потомства могло сыграть насыщение организма материнских особей и плода во время беременности витаминами и минералами, однако это лишь гипотеза, требующая более детального изучения.

В качестве одного из главных антагонистов свинца в состав БПК был включён препарат кальция. Свинец, обладающий свойством ионной мимикрии, способен вытеснять Ca²⁺ из кальций-зависимых регуляторных процессов и ферментных систем, тем самым опосредуя нейротоксические эффекты [12, 13]. Стоит отметить, что на фоне токсического действия химических веществ увеличивается потребность в микро- и макроэлементах. Это вызывает относительный дефицит, в том числе и кальция. Следовательно, могут существенно усилиться токсические эффекты свинцовой интоксикации.

Ещё одним компонентом, снизившим токсические эффекты ацетата свинца, вероятно, стали ПНЖК. Наличие нейропротекторного эффекта у ПНЖК подтверждено в экспериментальных моделях in vivo: доказана способность докозагексаеновой кислоты благоприятно влиять на сохранение когнитивных функций лабораторных животных на фоне нейровоспалительных реакций [14]. Отмечена способность ПНЖК индуцировать ремиелинизацию нервных волокон и препятствовать деградации основного белка миелина [15]. В качестве стабилизаторов мембран клеток в составе БПК использовались соли глютаминовой кислоты и глицин, эффективные мембраностабилизирующие свойства которого объясняют антицитотоксическое действие, связанное с интенсификацией синтеза аденозинтрифосфата (АТФ). Натриевая соль глутаминовой кислоты является предшественником восстановленного глютатиона, который оказывает протекторный эффект при оксидативном стрессе [16]. Согласно научным данным, глутамат участвует в синаптической передаче сигналов возбуждения в ЦНС [17, 18]. Особую роль в формировании поведенческих реакций, процессах обучения и когнитивной деятельности играет активация NMDA-рецепторов под действием глутамата [18–20], дисфункция которых приводит к развитию нейродегенеративных болезней (болезнь Альцгеймера, психические расстройства, эпилепсия и др.) [21–24]. Это позволяет ожидать протекторный эффект глутамата в отношении нервной системы в реализованном эксперименте.

Ограничения исследования. В данном исследовании прямую экспозицию ацетатом свинца и введение БПК не осуществляли в период спаривания крыс, беременности и лактации. Не был оценён гендерный вклад обоих полов в наблюдаемые токсические эффекты у потомства экспериментальных лабораторных животных. Вероятно, мужчины и женщины имеют разный адаптационный потенциал и устойчивость к токсическому действию тяжёлых металлов, что с точки зрения гигиены труда может играть важную роль в полной и достоверной оценке рисков для здоровья групп риска и их потомства. Одновременно представляется целесообразным дальнейшее исследование с использованием экспериментальных моделей in vivo, направленное на оценку эффективности БПК при его длительном применении на протяжении нескольких поколений.

Заключение

Сравнительный анализ свидетельствует о неоднородном характере изменений поведенческих реакций у родительского звена крыс, получавших свинец, и их потомства. У поколения F0 группы Pb в большей степени наблюдалось снижение когнитивной функции и исследовательской активности, в то время как у крыс F1 преобладали признаки дезадаптации и дезориентации, обусловленные тормозными процессами в ЦНС. Это обосновывает риски не только для здоровья людей, подверженных воздействию свинца в среде обитания и рабочей зоне, но и для их потомства, что делает вопрос о превентивных мерах по предотвращению таких последствий более актуальным. В настоящем эксперименте впервые была показана возможность мер биологической профилактики не только повышать резистентность животных, получавших БПК, но и снижать выраженность отдалённых нейротоксических эффектов у их потомства, не подверженного прямой экспозиции свинцом, преимущественно за счёт снижения опосредованного воздействия токсиканта через кровь во время беременности и через молоко в период грудного вскармливания.

¹ WHO. Lead poisoning. 2023. URL: https://www.who.int/ru/news-room/fact-sheets/detail/lead-poisoning-and-health

² МУК 4.1.1483–03. Определение содержания химических элементов в диагностируемых биосубстратах, препаратах и биологически активных добавках методом масс-спектрометрии с индуктивно связанной аргоновой плазмой: методические указания: утв. Глав. гос. сан. врачом РФ 29.06.2003 г. М.: Федеральный центр госсанэпиднадзора Минздрава России, 2003. 36 с.

³ Методические указания по спектральным методам определения микроэлементов в объектах окружающей среды и биоматериалах при гигиенических исследованиях: утв. Минздравом СССР 20.01.1987 г. № 42–46–87. М., 1987.

⁴ МР 1.2.0382–25 «Методические рекомендации по оценке поведенческих, когнитивных, эмоциональных, сенсорных функций и социального поведения у животных в токсикологических исследованиях».