Применение молекулярно-генетических методов исследования в диагностике систолической дисфункции миокарда у работников угольной отрасли Кузбасса

Введение

В последние десятилетия в Российской Федерации проводится модернизация производства с целью улучшения условий труда работников и сохранения здоровья трудоспособного населения. Тем не менее современные условия труда, особенно в горнодобывающей промышленности, характеризуются комплексным воздействием на рабочих вредных производственных факторов, концентрации и уровни которых часто превышают гигиенические нормативы [1, 2]. По данным Главного профпатолога Минздрава России И.В. Бухтиярова, почти 79% работников, обеспечивающих добычу каменного и бурого угля, испытывают на себе комбинированное воздействие вредных и опасных промышленных факторов производственной среды [3]. При этом определённая часть известных вредных факторов в условиях шахты не может быть устранена даже самыми современными и эффективными технологиями. К ним относятся высокое атмосферное давление и его резкие перепады на разной высоте, отсутствие солнечного освещения, ограниченное пространство, вынужденная поза при выполнении работы, а также психоэмоциональные нагрузки [2].

Показано, что сочетание вредных условий труда с генетическими, соматическими и психоэмоциональными факторами риска способствует раннему развитию и прогрессированию болезней системы кровообращения (БСК), осложнения которых приводят к инвалидизации и смертности лиц трудоспособного возраста, в том числе и на рабочих местах [4, 5]. При обследовании шахтёров Ростовской области выявлено, что у подземных работников, имеющих установленную профессиональную патологию, стандартизованный относительный риск смерти от кардиоваскулярной патологии в 1,5 раза превышал аналогичный показатель городского населения из группы контроля [6].

В последние годы опубликовано много работ, указывающих на важную роль жёсткости сосудистой стенки как фактора развития кардиоваскулярной патологии [7, 8]. При этом повышенная жёсткость артерий относится к более значимым предикторам развития сердечно-сосудистых осложнений, нежели возраст, гипертрофические изменения левого желудочка (ЛЖ), высокий уровень холестерина и глюкозы [9]. В основе изменений сосудистой стенки лежат врождённые или приобретённые изменения различных структур соединительной ткани [10, 11].

Коллагены I и III типов – наиболее распространённые формы, обеспечивающие эластичность и жёсткость ткани при регулярной механической нагрузке, при этом коллаген I типа составляет около 80% всех толстых волокон, которые обеспечивают прочность миокарда на растяжение [7, 12]. Количество коллагеновых волокон, их распределение и организация – основные критерии функциональности сердца, а структурные изменения внеклеточного матрикса способствуют нарушению геометрии ЛЖ и формированию систолической и диастолической дисфункции [13, 14]. Установлено, что нарушения структуры и синтеза коллагена, приводящие к изменению механических свойств сосудистой стенки, могут быть ключевым фактором сосудистых катастроф [8, 15]. Структурные изменения в молекуле коллагена могут быть вызваны полиморфными вариантами генов, кодирующих синтез данного белка, в результате которых возникает несколько аллельных вариантов из-за точечных мутаций, нередко затрагивающих всего один нуклеотид. В геноме человека обнаружено более 1 млн однонуклеотидных полиморфизмов – Single Nucleotide Polymorphism (SNP). Подобный полиморфизм в участке молекулы ДНК, несущем генетическую информацию, может изменить последовательность аминокислот белка, что приведёт к нарушению его функции [16, 17]. Результаты многочисленных исследований подтверждают, что индивидуальная восприимчивость к воздействию промышленных факторов имеет генетическую детерминированность [18–20].

Ген COL1A1 кодирует α-1 цепь – одну из трёх цепей, входящих в структуру коллагена I типа, играющего важную роль в формировании эластических свойств крупных сосудов. Наиболее изученной однонуклеотидной заменой является полиморфизм rs1800012 гена COL1A1 (c.1245G>T), характеризующийся заменой гуанина (G) на тимин (Т) в первом интроне. Полиморфная замена в некодирующей области гена приводит к сдвигу нормального соотношения аминокислот в молекуле коллагена, что способствует усилению продукции цепи α-1 над α-2, приводя к нарушению сборки коллагена и снижению его количества, последующему уменьшению эластичности артерий [8, 21–23]. В связи с этим актуально изучение полиморфных вариантов гена COL1A1 для выявления индивидуальной предрасположенности к начальным признакам сердечной недостаточности (СН), что позволит осуществлять персонифицированную доклиническую диагностику и своевременную профилактику сердечно-сосудистых осложнений.

Цель исследования – анализ вклада полиморфного локуса rs1800012 гена COL1A1 в формирование систолических нарушений в виде снижения глобальной продольной деформации миокарда левого желудочка у шахтёров Кузбасса.

Материалы и методы

При периодических медицинских осмотрах в клинике Научно-исследовательского института комплексных проблем гигиены и профессиональных заболеваний (НИИ КПГПЗ) выполняли отбор пациентов. Для анализа вклада полиморфного варианта COL1A1 (rs1800012) в формирование систолических нарушений у шахтёров Южно-Кузбасской агломерации обследовали стажированных работников основных профессий угольной отрасли (горнорабочие подземные, проходчики, горнорабочие очистного забоя, машинисты горных выемочных машин): n = 159, мужчины, средний возраст 46,74 ± 0,72 года, непрерывный производственный стаж не менее 20 лет. Рабочие были распределены на две группы в зависимости от отсутствия или наличия нарушений систолической функции миокарда в виде снижения показателя глобальной продольной деформации (global longitudinal strain – GLS) левого желудочка. Основную группу составили 46 подземных рабочих с нарушением систолической функции миокарда в виде снижения GLS, группа сравнения сформирована из 113 шахтёров с нормальной GLS.

Всем пациентам проведено ультразвуковое исследование сердца с помощью неинвазивной технологии speckle-tracking, позволяющей более точно оценить механику миокарда, выявить субклинические нарушения сердечной функции и прогнозировать неблагоприятные исходы при различных БСК [7]. При speckle-tracking эхокардиографии выполнен автоматический расчёт показателя GLS. Использовано программное обеспечение AFI при стабильной регистрации ЭКГ в трёх верхушечных позициях (четырёхкамерной, пятикамерной и двухкамерной). Нормальным значением GLS считали показатель –18%.

Из исследования исключали шахтёров с органическими поражениями сердца, злокачественными нарушениями ритма и имплантированными устройствами для его коррекции, кардиомиопатиями любого генеза, ишемической болезнью сердца (ИБС) и артериальной гипертензией (АГ) высокой степени, сахарным диабетом и другими выраженными соматическими патологиями.

Материалом для исследования служила ДНК, выделенная из замороженных образцов цельной венозной крови. Кровь отбирали из локтевой вены в пробирки с антикоагулянтом ЭДТА-К3. Геномную ДНК осаждали ледяным этиловым спиртом (96°) с последующим растворением в 120 мкл деионизованной воды и хранением в морозильной камере при температуре минус 20 °С. Для определения вклада генетических маркёров в процессы фиброзирования и ремоделирования миокарда был изучен полиморфный вариант rs1800012 гена COL1A1 методом аллель-специфичной ПЦР в режиме реального времени. Амплификацию специфичных участков ДНК проводили наборами праймеров ООО «СибДНК» (Новосибирск) на амплификаторе ДТпрайм-4 (ООО «НПО ДНК-Технология», Москва).

Исследование было выполнено в соответствии с научными принципами Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации (ред. 2013 г.) после получения одобрения биоэтического комитета ФГБНУ «Научно-исследовательский институт комплексных проблем гигиены и профессиональных заболеваний» (протокол заседания 4 (§1) от 21.11.2024 г.) и письменного согласия всех обследованных лиц в соответствии с Федеральным законом № 323-ФЗ от 21.11.2011 г. (в редакции от 29.12.2015 г.).

Обработку материала проводили в статистических программах IBM SPSS Statistics Version 22 для Windows и SNPStats. Независимое распределение генотипов в обеих изученных группах проверяли на соответствие равновесному состоянию по закону Харди – Вайнберга. Для сравнения частот встречаемости генотипов и аллельных вариантов в группах шахтёров с нормальной и сниженной GLS использовали критерий χ². Для выявления ассоциаций определённых генотипов и аллелей полиморфного локуса COL1A1 (rs1800012) с нарушением систолической функции применяли отношение шансов (OR) с указанием 95%-го доверительного интервала (95% CI). Интерпретировали полученные результаты следующим образом: при OR > 1 выявляли фактор риска в группе шахтёров с систолическими нарушениями, при OR < 1 судили об обратной связи изученного генотипа или аллели с вероятностью исхода. Статистическую значимость OR оценивали с помощью доверительного интервала. Если обе границы 95% CI были выше или ниже единицы, выявленную связь считали статистически значимой, если 95% CI пересекал единицу, то обнаруженные различия считали незначимыми.

Результаты

Данный фрагмент исследования был осуществлён в рамках широкой темы, связанной с комплексным изучением роли традиционных и эндогенных факторов риска формирования болезней системы кровообращения (БСК) среди условно здоровых (без тяжёлой соматической патологии) стажированных работников угольной отрасли Кузбасса.

В изученных группах были обнаружены все искомые мутации в гомо- и гетерозиготном состоянии. В группе шахтёров с нормальной GLS распределение частот генотипов и аллелей гена COL1A1 (rs1800012) соответствовало равновесию Харди – Вайнберга (HWE). У шахтёров со сниженной GLS выявлено отклонение в распределении некоторых генотипов, что не было технической ошибкой, а характеризовало данную выборку. Несоблюдение равновесия было вызвано недостатком гетерозигот и переизбытком гомозигот по минорной аллели Т среди горнорабочих с нарушенной систолической функцией (табл. 1). Науке известны различные причины отклонения от HWE по определённым маркёрам. Доказано, что нарушение равновесного состояния в выборках больных людей может свидетельствовать о связи между изученным маркёром и восприимчивостью к болезни [24].

Результаты анализа распределения частот генотипов и аллелей исследуемых полиморфных вариантов представлены в табл. 2. При изучении полиморфного локуса rs1800012 гена COL1A1 выявлено четырёхкратное повышение частоты гомозиготного генотипа Т/Т в группе шахтёров со снижением GLS по сравнению с работниками с нормальной систолической функцией (15,2% против 3,6%; χ² = 7,17; р = 0,028). Средняя частота встречаемости гомозиготного варианта по аллели Т в европейской популяции составляет 5–8% [25].

Анализ распределения частот аллелей полиморфизма rs1800012 гена COL1A1 выявил статистически значимое увеличение частоты аллели T у шахтёров со сниженной GLS (25% против 12,8% в группе сравнения). Рассчитанная величина OR показала, что носительство минорной аллели T и гомозиготного генотипа Т/Т повышает вероятность развития нарушений систолической функции сердца в виде снижения GLS в 2,26 (OR = 2,26; 95% CI [1,23–4,18]) и 4,9 раза (OR = 4,89; 95% CI [1,36–17,62]) соответственно.

Известно, что полиморфная замена аллели G на аллель Т может приводить к повышенной экспрессии α-1 цепи над α-2 цепью, способствуя нарушению сборки коллагена и уменьшению его количества, следовательно, и снижению эластичности сосудов [21–23].

В нашем исследовании невозможно сделать однозначный вывод о роли гомозиготы по аллели G в формировании систолической дисфункции, поскольку доверительный интервал для OR пересекал значение 1. Однако у лиц с нормальной GLS генотип G/G гена COL1А1 (rs1800012) встречался в 77,8% случаев, а у шахтёров со сниженной GLS –  65,2% (р = 0,028), что может свидетельствовать о вероятном протективном влиянии генотипа. При этом анализ частоты аллелей выявил статистически значимое повышение частоты дикой аллели G у работников с нормальной систолической функцией по сравнению с шахтёрами со снижением GLS (87,2% против 75%), что позволяет сделать вывод о его протективном эффекте в отношении развития систолической дисфункции у работников угольных шахт.

Обсуждение

Формирование у рабочих различных отраслей промышленности не только профессиональной, но и производственно обусловленной патологии изучено разносторонне, в том числе это относится к БСК, имеющим наиболее частые осложнения в виде СН [5, 26–28]. Появляется всё больше публикаций, свидетельствующих о ключевой роли показателя жёсткости сосудов в формировании БСК, что увеличивает постнагрузку на ЛЖ, способствует его гипертрофии и риску СН [7, 8]. Показано, что жёсткость сосудов относится к независимым предикторам кардиоваскулярных катастроф. Жёсткость же артерий, развивающаяся в результате структурных изменений сосудистой стенки в виде повышенного накопления внеклеточного матрикса, утолщения фиброэластического компонента интимы и нарушения структурно-функциональных характеристик коллагена, может быть обусловлена генетическими особенностями индивида [29]. В связи с высокой частотой БСК среди работников угольной промышленности актуально выявление ранних предикторов сердечно-сосудистых катастроф для определения групп повышенного риска, разработки персонифицированного подхода к доклинической диагностике и рациональной профилактике кардиоваскулярных патологий.

При изучении полиморфного локуса COL1A1 (rs1800012) в нашем исследовании обнаружена статистически значимая ассоциация минорной аллели T и гомозиготного генотипа Т/Т с формированием нарушений систолической функции сердца в виде снижения показателя продольной деформации ЛЖ (OR = 2,26; 95% CI: 1,23–4,18 и OR = 4,89; 95% CI: 1,36–17,62 соответственно). Среди шахтёров со снижением продольной систолической деформации ЛЖ выявлено значимое преобладание носителей аллели T (25% против 12,8%) и гомозиготного варианта по минорной аллели (15,2% против 3,6%) в отличие от шахтёров с нормальной систолической функцией.

Для аллели G установлен протективный эффект в отношении развития систоличеcкой дисфункции у стажированных шахтёров. Вероятность выявить данную аллель среди лиц с нарушенной систолической функцией уменьшалась в 2,3 раза (OR = 0,44; 95% CI: 0,24–0,81). Аналогичные данные получены при обследовании жителей Белоруссии с хронической обструктивной болезнью лёгких (ХОБЛ). Частота гомозиготного генотипа G/G была ниже у пациентов с ХОБЛ по сравнению со здоровыми лицами (59,3% против 86%). При этом у лиц с ХОБЛ почти в 3,5 раза чаще встречался гомозиготный вариант по аллели Т по сравнению с контрольной группой (6,8% и 2% соответственно) [30].

Полиморфный вариант гена COL1A1 (2046 G->T) представляет собой точечную замену нуклеотида гуанина на тимин, приводящую к нарушению сайта связывания для фактора транскрипции гена коллагена I типа в области первого интрона. Обладатели редкого варианта Т/Т имеют нарушение баланса субъединиц в молекуле коллагена, способствующего ухудшению его механических свойств. Показана склонность носителей мутантной аллели Т и гомозиготного варианта по данной аллели к остеопорозу, переломам костей, травмам связочного аппарата, пролапсу тазовых органов и структурным изменениям сосудистой стенки, способствующим формированию кардиоваскулярной патологии [31–33].

Известно, что полиморфизм гена α-1 цепи коллагена I типа COL1A1 способствует развитию БСК, связанных с повышением артериальной жёсткости. Показана ассоциация минорной аллели T гена COL1A1 со сниженной эластичностью артерий у здоровых молодых людей. Повышенная жёсткость сосудов связана с дисфункцией эндотелия, усилением активности ангиотензин-превращающего фермента (АПФ), способствующего повышению синтеза ангиотензина II и активации ренин-ангиотензин-альдостероновой системы. Показано, что в результате нарушения функции эндотелия могут выявляться не только снижение продукции NO, но и его ускоренная деградация и ремоделирование сосудов [8].

Исследование изменений системы кровообращения и опорно-двигательного аппарата у спортсменов с полиморфизмами гена COL1A1 показало вклад функционально неблагоприятного генотипа Т/Т в формирование нарушений процесса релаксации миокарда, а также морфологических изменений сердца и крупных сосудов [34].

При изучении состояния системы кровообращения у военнослужащих Военно-морского флота выявлена ассоциация полиморфного варианта Т/Т гена COL1А1 (rs1800012) с уменьшением диаметра аорты и увеличением сосудистой жёсткости. Авторы указывают, что наиболее благоприятным является гомозиготный полиморфный вариант G/G, ассоциированный с нейтральным значением показателей, характеризующих систему кровообращения [35]. В исследовании Тилик Т.В. выявлено увеличение частоты аллели T, а также генотипов T/T и G/T гена COL1A1 (rs1800012) у пациентов с ХОБЛ, сочетанной с ИБС. Авторы делают вывод о том, что носительство мутантной аллели Т и содержащих его генотипов является важным фактором формирования дисметаболизма соединительной ткани при сочетании ХОБЛ с ИБС [36].

При этом изучение риска развития патологий грудной артерии у польских пациентов не подтвердило связи с генетическими полиморфизмами COL1A1 rs1800012 (c.1245G>T) и COL1A2 rs42524 (c.1645G>C). В группах пациентов с расслоением грудной аорты и аневризмой восходящей аорты не было обнаружено существенных отличий в распределении частот генотипов или аллелей COL1A1 и COL1A2 от пациентов контрольной группы [37]. При анализе отечественной и зарубежной литературы выявлено, что в большинстве исследований, связанных с оценкой полиморфного локуса COL1А1 (rs1800012), изучена роль данного полиморфизма в развитии патологии опорно-двигательного аппарата или структурно-функциональных нарушений соединительной ткани органов малого таза. Работы, посвящённые изучению ассоциативных связей полиморфизма rs1800012 гена COL1A1 с формированием кардиоваскулярной патологии, единичны и чаще всего проведены на популяционных выборках. Поэтому дальнейшее исследование полиморфного варианта гена COL1A1 (2046 G->T) и его взаимодействия с другими генетическими маркёрами в профессиональных когортах лиц представляется актуальной задачей. Решение её позволит своевременно выявлять работников с начальными признаками сердечной недостаточности и таким образом снизить вероятность развития сердечно-сосудистых катастроф.

Ограничения исследования. Проведённое исследование ограничено количеством генетических полиморфизмов, играющих роль в нарушении систолической функции миокарда.

Заключение

Развитие систолической дисфункции сердца у шахтёров юга Кузбасса ассоциируется с мутацией гена COL1A1 (rs1800012), характеризующейся заменой гуанина (G) на тимин (Т) в первом интроне. Обнаружена предрасположенность шахтёров, обладающих минорной аллелью T и гомозиготным генотипом Т/Т, к формированию нарушений систолической функции сердца в виде снижения показателя продольной деформации левого желудочка. Аллель Т и гомозиготный вариант Т/Т являются предикторами систолической дисфункции у стажированных подземных работников угольной отрасли. Аллель G связана с резистентностью к снижению глобальной продольной деформации левого желудочка и обладает протективным эффектом в отношении развития систоличеcкой дисфункции у стажированных шахтёров.

Проведённое исследование подтверждает вклад полиморфного локуса COL1A1 (rs1800012) в формирование систолических нарушений у стажированных шахтёров Кузбасса, что можно использовать для разработки персонифицированного подхода к доклинической диагностике болезней системы кровообращения и их возможных осложнений у работников угледобывающей промышленности.