Полиморфизм гена VEGFA (rs2010963) и низкоуровневая экспозиция никелем как факторы модификации запрограммированной клеточной гибели у жителей Крайнего Севера

Введение

Динамичное развитие цветной металлургии приводит к загрязнению атмосферного воздуха высокотоксичными тяжёлыми металлами и их соединениями, что значительно повышает риск развития различных нарушений здоровья населения промышленных центров независимо от климатогеографических особенностей территорий их размещения. Никель, один из наиболее распространённых тяжёлых металлов, загрязняющих окружающую среду, обладает мутагенными, канцерогенными и иммунотропными, в том числе сенсибилизирующими свойствами [1, 2].

Совокупность экзогенных химических и климатогеографических факторов промышленных центров Крайнего Севера определяет специфику адаптационных реакций организма, когда изменения иммунной регуляции могут затрагивать апоптоз ‒ процесс запрограммированной клеточной гибели, играющий важную роль в обновлении тканей и поддержании тканевого гомеостаза [3, 4]. Дисрегуляция программируемой клеточной гибели может быть напрямую связана не только с повышением риска канцерогенеза или аутоиммунных процессов, но и с ускорением физиологического старения организма [5, 6]. При этом полиморфные варианты кандидатных генов регуляции клеточной пролиферации и дифференциации могут характеризовать наследственную предрасположенность к модификации иммунного профиля и повышенному риску нарушений апоптоза [7, 8]. Так, полиморфные варианты гена фактора роста эндотелия сосудов VEGFA (rs2010963), ключевого фактора васкуло- и ангиогенеза, также могут лежать в основе генетически детерминированного дисбаланса клеточной пролиферации и гибели [9].

Таким образом, изучение особенностей иммунного профиля и запрограммированной клеточной гибели, ассоциированных с экспозицией никелем и полиморфными вариантами гена VEGFA (rs2010963), является актуальным направлением в аспекте обоснования комплекса генетических и иммунологических маркёров, обусловливающих формирование особенностей донозологической модификации апоптоза при сочетанном воздействии химических и климатических факторов.

Цель работы ‒ изучить особенности модификации запрограммированной клеточной гибели у населения трудоспособного возраста территорий Крайнего Севера в условиях низкоуровневой аэрогенной экспозиции тяжёлыми металлами и полиморфизма гена VEGFA (rs2010963) (на примере никеля).

Материалы и методы

Проведено клинико-лабораторное обследование взрослого трудоспособного населения (возраст от 21 года до 59 лет), проживающего на территориях с субарктическим и континентальным типами климата при различных уровнях аэрогенного воздействия никеля. Группа наблюдения 1 – 255 человек, проживающих в крупном промышленном центре с субарктическим типом климата. Группа сравнения 1 – 90 человек, проживающих в относительно чистом районе с субарктическим климатом. Группа наблюдения 2 – 86 человек, проживающих в крупном промышленном центре с континентальным типом климата. Группа сравнения 2 – 94 человека, проживающих в относительно чистом районе с континентальным типом климата. Выборки сопоставимы по полу, возрасту, этническому составу, социальному статусу.

Расчёт среднесуточных доз никеля при ингаляционном поступлении для взрослого населения выполнен по данным баз стационарных и передвижных источников выбросов, сформированных в рамках реализации Федерального проекта «Чистый воздух» и национального проекта «Экология»¹.

Уровень контаминации крови никелем определяли методом масс-спектрометрии с индуктивно связанной плазмой на приборе Agilent 7500сх (Agilent Technologies Inc., США). Регистрацию запрограммированной клеточной гибели лимфоцитов Annexin V-FITC⁺7AAD^–-клетки и Annexin V-FITC⁺7AAD⁺-клетки проводили методом проточной цитометрии на приборе FACSCalibur (Becton Dickinson, США). Уровень продукции фактора роста эндотелия сосудов VEGF определяли методом иммуноферментного анализа (ИФА) на приборе BioTek ELx808 (BioTek Instruments Inc., США). Количественное определение маркёра специфической гиперсенсибилизации IgE к никелю проводили посредством аллергосорбентного тестирования с ферментной меткой на приборе Sunrise Tecan (Tecan Austria GmbH, Австрия).

Идентификация полиморфных вариантов – однонуклеотидной замены G(-634)C гена фактора роста эндотелия сосудов VEGF-A VEGFA (rs2010963) – выполнена c использованием соответствующей тест-системы (ЗАО «Синтол», Россия) методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени на приборе CFX96 Real Time System C1000 Thermal Cycler (BioRAD, Сингапур).

Статистическая обработка полученных результатов проведена с использованием методов математической статистики и реализована в программах Microsoft Office Excel 2010, Statistica 10.0 (StatSoft, США). Статистическая обработка генетических данных реализована с расчётом параметров мультипликативной и общей моделей наследования: частот аллелей и генотипов, отношения шансов OR и их доверительных интервалов CI, критерия χ², а также относительного риска RR в программе Microsoft Office Excel 2010. Анализ результатов молекулярно-генетического анализа проведён с расчётом параметров мультипликативной и общей моделей наследования в Microsoft Office Excel 2010.

Многофакторное моделирование выполнено на основе методов линейного регрессионного анализа. В качестве предикторов использованы значения факторов и их бинарные комбинации; зависимыми переменными выступили показатели запрограммированной клеточной гибели (Annexin V-FITC⁺7AAD^–-клетки и Annexin V-FITC⁺7AAD⁺), уровень продукции фактора роста эндотелия сосудов (VEGF), а также маркёр специфической гиперсенсибилизации IgE к никелю. Общий вид регрессионного уравнения представлен формулой (1):

y = b₀ + b₁C_N + b₂G_C/C + b₃G_G/C + b₄K_S + b₅C_NG_C/C + b₆C_NG_G/C + b₇C_NK_S, (1)

где y – зависимая переменная (Annexin V-FITC⁺7AAD^–-клетки, Annexin V-FITC⁺7AAD, VEGF, IgE к никелю); C_N – концентрация никеля в крови, мкг/л; G_C/C, G_G/C – индикаторы однонуклеотидной замены G(-634)C гена фактора роста эндотелия сосудов VEGFA (rs2010963), принимают значения 1 при наличии или 0 при отсутствии; K_S – индикатор климатической зоны, принимает значения 1 для субарктической или 0 для континентальной зоны); b₀–b₇ – параметры регрессионной модели.

Результаты

По результатам гигиенической оценки качества атмосферного воздуха сравниваемых территорий среднесуточная доза аэрогенной экспозиции никелем взрослого населения промышленного центра с субарктическим типом климата составила 1,36 ∙ 10^–³ мг/(кг ∙ день) (0,12 ПДК_с.с.), тогда как для взрослого населения промышленного центра с континентальным типом климата данный показатель составил 9,58 ∙ 10^–⁴ мг/(кг∙день) (0,085 ПДК_с.с.)².

По результатам химико-аналитического исследования биосред концентрация никеля в крови взрослых лиц трудоспособного возраста (от 21 года до 59 лет), проживающих в промышленном центре Крайнего Севера, – 0,0123 ± 0,0015 мкг/см³ (группа наблюдения 1), в 3,8 раза превышает концентрацию у обследованных на соответствующей условно чистой территории – 0,0032 ± 0,0007 мкг/см³ (p = 0,001), а также референтный уровень 0‒0,01 мкг/см³ (p = 0,001–0,025). Содержание данного металла в крови взрослого населения промышленного центра на территории средней широты (группа наблюдения 2) составило 0,00822 ± 0,001 мкг/см³, что также в 2,5 раза превышает уровень в соответствующей группе сравнения – 0,0033 ± 0,0006 мкг/см³ (p = 0,001). При этом уровень контаминации крови никелем в группе наблюдения 1 повышен в 1,5 раза по отношению к группе наблюдения 2 (p = 0,019).

Иммунный профиль 63,5% обследованных взрослых в группе наблюдения 1 и 59,8% в группе наблюдения 2 отличается достоверным повышением содержания циркулирующих клеток в стадии инициации апоптоза (AnnexinV-FITC⁺7AAD^–), ассоциированным с повышением контаминации крови никелем, по отношению к соответствующим группам сравнения, что указывает на признаки активации запрограммированной клеточной гибели в условиях низкодозового воздействия никеля (р = 0,016–0,048) (табл. 1, 2).

При этом содержание AnnexinV-FITC⁺7AAD^–-клеток у взрослых в условиях аэрогенной экспозиции никелем в среднесуточной дозе 1,36 ∙ 10^–³ мг/(кг ∙ день) и субарктического климатического режима (группа наблюдения 1) в 2,2 раза снижено по отношению к аналогичной выборке в условиях внешнесредового воздействия данного химического фактора на уровне 9,58 ∙ 10^–4 мг/(кг ∙ день) и континентального климата (группа наблюдения 2) (p = 0,001). Относительное содержание клеток на ранней стадии апоптоза у взрослых в промышленном центре (группа наблюдения 1) и на условно чистой территории Крайнего Севера (группа сравнения 1) достоверно снижено относительно референтного уровня (1,5–2,5%) (p = 0,013–0,035) в 1,6 и в 2,3 раза соответственно.

Содержание Annexin V-FITC⁺7AAD⁺-клеток как маркёра позднего апоптоза и некроза у взрослого населения в условиях аэрогенной экспозиции никелем в условиях субарктического и континентального типов климата (группы наблюдения 1 и 2) достоверно повышено по отношению к аналогичным выборкам на условно чистых территориях (группы сравнения 1 и 2) (p = 0,029–0,042). Содержание Annexin V-FITC⁺7AAD⁺-клеток у взрослых в условиях аэрогенной экспозиции никелем в среднесуточной дозе 1,36 ∙ 10^–³ мг/(кг ∙ день) на Крайнем Севере снижено по отношению к лицам, проживающим в условиях континентального климата, при среднесуточной дозе, формируемой аэрогенной экспозицией никелем на уровне 9,58 ∙ 10^–⁴ мг/(кг ∙ день) (p = 0,034).

Уровень продукции IgE к никелю у обследованных в промышленных центрах с субарктическим и резко континентальным климатом (группы наблюдения 1 и 2) достоверно превышает данный показатель у взрослых на аналогичных условно чистых территориях (группы сравнения 1 и 2) (p = 0,001–0,04). В то же время уровень специфической гаптенной сенсибилизации у взрослых в условиях аэрогенной экспозиции никелем в среднесуточной дозе 1,36 ∙ 10^–³ мг/(кг ∙ день) на Крайнем Севере (группа наблюдения 1) и при его внешнесредовом воздействии на уровне 9,58 ∙ 10^–⁴ мг/(кг ∙ день) на территории средней широты (группа наблюдения 2) является сопоставимым (p = 0,467).

Концентрация фактора роста эндотелия сосудов VEGF у обследованных в промышленном центре на Крайнем Севере (группа наблюдения 1), а также у взрослых на урбанизированной территории средней широты (группа наблюдения 2), соответственно у 52,4 и 45,7% обследованных, достоверно повышена по отношению к аналогичным группам на условно чистых территориях (группы сравнения 1 и 2) (p = 0,001–0,04). Содержание VEGF в сыворотке крови обследованных в группе наблюдения 1 достоверно превышает его значение в группе наблюдения 2 (p = 0,043).

По результатам сравнительной оценки особенностей генетического профиля обследованных взрослых, проживающих на территории с субарктическим климатом в условиях низкоуровневой аэрогенной экспозиции никелем (группа наблюдения 1), отмечено достоверное повышение частоты вариантных С-аллели и СС-генотипа гена фактора роста эндотелия сосудов VEGFA (rs2010963) (p = 0,039–0,048) по отношению к частотности полиморфизма данного гена в выборке на соответствующей условно чистой территории (группа сравнения 1) (табл. 3).

Сравнительная оценка особенностей полиморфизма гена эндотелиального фактора роста позволила установить достоверно повышенную частоту вариантных С-аллели и СС-генотипа гена VEGFA (rs2010963) у взрослых в условиях низкоуровневой аэрогенной экспозиции никелем и субарктического климата (группа наблюдения 1) по отношению к взрослым, проживающим в промышленном центре на территории средней широты (группа наблюдения 2). Таким образом, возникает риск формирования нарушений, сопряжённых с компетенцией данного гена, ассоциированных с негативной модификацией клеточной гибели и ангиогенеза (p = 0,041).

Анализ множественных регрессионных моделей системы причинно-следственных связей позволил установить, что экстремальные субарктические условия, независимо от генетической детерминации и контаминации крови никелем, формируют более выраженный дисбаланс иммунорегуляторных показателей (высокий уровень продукции VEGF и угнетение клеточной гибели Annexin V-FITC⁺7AAD^– и Annexin V-FITC⁺7AAD⁺-лимфоциты) по сравнению с условиями континентального климата. Показано, что контаминация крови никелем в диапазоне концентраций 0,006–0,033 мкг/см³ приводила к угнетению продукции VEGF и избыточной активации клеточной гибели в рамках процессов раннего (Annexin V-FITC⁺7AAD^–) и позднего (Annexin V-FITC⁺7AAD⁺) апоптоза у носителей СС- и GС-генотипов гена VEGFA (rs2010963) как в условиях субарктического, так и континентального климата. Построенные многофакторные модели позволили выявить достоверную множественную линейную зависимость клеточной гибели (по критериям апоптоза Annexin V-FITC⁺7AAD^–, некроза Annexin V-FITC⁺7AAD⁺ и фактора роста VEGF) от концентрации никеля в крови, которая демонстрирует развитие дисбаланса иммунорегуляторных показателей независимо от климатического и генетического фона. Наиболее выраженные проявления негативного сценария формирования апоптотических фенотипов (максимальное содержание Annexin V-FITC⁺7AAD^–, Annexin V-FITC⁺7AAD⁺, минимальные уровни продукции VEGF) наблюдаются в условиях субарктического климата и контаминации биосред никелем у обладателей мутантной С-аллели гена VEGFA (rs2010963).

Обсуждение

Ранее проведёнными исследованиями подтверждается важнейшая роль в защитно-адаптивных реакциях организма иммунной системы, определяющей интегральную реактивность при воздействии стрессорных факторов различной природы [10]. Результаты многочисленных исследований иммунного профиля как коренного, так и пришлого населения Крайнего Севера, в том числе вахтовых рабочих, указывают на признаки дезадаптационной функциональной перестройки клеточного иммунитета и модулирования запрограммированной клеточной гибели в особых климатогеографических условиях данной территории [11].

Так, по результатам настоящего исследования установлено, что низкодозовая аэрогенная экспозиция никелем на уровне 9,58 ∙ 10^–⁴ – 1,36 ∙ 10^–³ мг/(кг ∙ день) обусловливает повышение содержания апоптотических иммуноцитов на ранней (AnnexinV-FITC⁺7AAD^–) и поздней (AnnexinV-FITC⁺7AAD⁺) стадиях клеточной гибели у взрослого населения трудоспособного возраста (p = 0,016–0,048), что соотносится с результатами исследований на выборках детского населения различных климатических зон и рабочих промышленных предприятий [12, 13]. При этом особенности модификации запрограммированной клеточной гибели при аэрогенной экспозиции никелем у взрослого населения промышленно развитых территорий остаются малоизученными.

По мнению авторов [14, 15], в условиях холодового климата отмечается значительное угнетение запрограммированной клеточной гибели, что корреспондируется с результатами настоящего исследования, когда у обследованных взрослых в промышленном центре и на условно чистой территории с субарктическим климатом по отношению к соответствующим группам в средних широтах показано достоверное снижение апоптоза по критерию экспрессии AnnexinV-FITC⁺7AAD^–, что указывает на вероятное преобладание угнетения апоптоза, сопряжённого с воздействием холодового фактора, которое частично отменяется низкоуровневой экспозицией никелем.

В ряде проведённых ранее исследований отмечено, что VEGF является активным митогеном и ингибитором запрограммированной клеточной гибели эндотелиальных и некоторых опухолевых клеток, обеспечивающим их выживание и пролиферацию [16]. По данным Wang J.C. и соавт., никель и его соединения, в том числе хлорид никеля, способствует повышению уровня продукции VEGF [17].

Полиморфизм гена данного сосудистого фактора VEGFA (rs2010963) представляет собой замену C>G в 5′-нетранслируемой области (5′-UTR) данного гена, регулирующей уровень его экспрессии. Вариантная С-аллель ассоциируется с повышением экспрессии гена и, следовательно, c повышением риска ингибирования апоптоза, тогда как G-аллель дикого типа – с угнетением экспрессии белка и повышением риска избыточной клеточной гибели [18]. Полиморфные варианты данного гена могут отражать генетически детерминированные изменения иммунного профиля и запрограммированной клеточной гибели в модифицированных условиях среды. Авторами [19, 20] изучены изменения иммунорегуляторных показателей, ассоциированные с полиморфными вариантами гена VEGFA (rs2010963) у работающих на промышленных предприятиях, тогда у населения промышленных центров, не занятого в производстве, аналогичные генетически детерминированные изменения иммунного профиля остаются малоизученными.

Следовательно, результаты настоящего исследования верифицируют и уточняют установленную связь между экспозицией химическими факторами среды обитания и изменений в иммунной системе (апоптотическая дизрегуляция) на фоне полиморфизма гена эндотелиального фактора роста VEGFA (rs2010963) у взрослого населения территорий, различающихся климатическими условиями и экспозицией тяжёлыми металлами (на примере никеля).

Заключение

Установлено, что низкоуровневая аэрогенная экспозиция никелем (0,12 ПДК_с.с.) создаёт нагрузку на уровне 1,36 ∙ 10^–³ мг/(кг ∙ день), которая в условиях экстремального климата Крайнего Севера формирует избыточную (0,0123 ± 0,0015 мкг/см³) контаминацию крови взрослых трудоспособного возраста (от 21 года до 59 лет) никелем, концентрация которого достоверно превышает верхнюю границу референтного диапазона (0–0,01 мкг/см³), значения в группах сравнения и в группе наблюдения 2 (континентальный климатический режим) (p = 0,001–0,019). Показано, что аэрогенная экспозиция никелем и условия холодового климата на фоне изменённого полиморфизма ключевого для апоптоза и ангиогенеза гена эндотелиального фактора роста VEGFA (rs2010963) (С-аллель и СС-генотип) модифицируют запрограммированную клеточную гибель и сопряжённые с ней иммунорегуляторные процессы (OR = 1,91 (1,03–3,55) ‒ 2,93 (1,31–6,57); RR = 1,19 (1,03–1,36); p = 0,005–0,038). Результаты многофакторного моделирования позволили выявить достоверные множественные линейные зависимости влияния на клеточную гибель (по критериям апоптоза Annexin V-FITC⁺7AAD^–, некроза Annexin V-FITC⁺7AAD⁺ и фактора роста VEGF) климата и контаминации крови никелем для различных модификаций полиморфизма гена VEGFA (rs2010963).

Таким образом, условия низкоуровневой аэрогенной экспозиции никелем, сопряжённые с минорной С-аллелью и СС-генотипом гена VEGFA (rs2010963), формируют негативные изменения апоптотического профиля (снижение AnnexinV-FITC⁺7AAD^–, повышение VEGF и IgE к никелю) у взрослых трудоспособного возраста, проживающих в условиях субарктического климата на Крайнем Севере. Рекомендуется использовать показатели иммуногенетического статуса AnnexinV-FITC⁺7AAD^–, VEGF и IgE к никелю, С-аллель и СС-генотип гена VEGFA (rs2010963) в качестве высокочувствительных молекулярно-генетических и иммунологических донозологических маркёров для задач диагностики и профилактики нарушений процессов клеточной гибели в условиях воздействия химических факторов для населения территорий с особым климатическим режимом.

¹ Р 2.1.10.3968‒23 «Руководство по оценке риска здоровью населения при воздействии химических веществ, загрязняющих среду обитания».

² СанПиН 2.1.3684-21 «Санитарно-эпидемиологические требования к содержанию территорий городских и сельских поселений, к водным объектам, питьевой воде и питьевому водоснабжению, атмосферному воздуху, почвам, жилым помещениям, эксплуатации производственных, общественных помещений, организации и проведению санитарно-противоэпидемических (профилактических) мероприятий».