Оценка нейротропности нанокомпозита оксида железа (II, III) в динамике постконтактного периода по изменению показателей электроэнцефалографии и поведенческих реакций у крыс

Введение

Основные области применения наночастиц (НЧ) – контрастные вещества для магнитно-резонансной томографии  (МРТ) и магнитные носители для доставки лекарств через гематоэнцефалический барьер, например, НЧ железа, при лечении болезни Альцгеймера, глиобластомы [1, 2]. Однако использование магнитных наночастиц (МНЧ) ограничено потенциальной токсичностью, которая зависит от их биосовместимости. Функционализация МНЧ лигандами повышает взаимодействие с организмом за счёт изменения заряда и формы МНЧ, предотвращения опсонизации, увеличения времени циркуляции МНЧ в крови и приводит к их накоплению только в необходимых органах [3]. Способы введения МНЧ в организм влияют на их токсичность и тканевую совместимость. В частности, интраназальное введение МНЧ вызывает морфологические изменения, активацию и пролиферацию микроглии в обонятельной луковице, гиппокампе и полосатом теле [4], а острое пероральное введение МНЧ приводит к ингибированию ацетилхолинэстеразы, Na⁺/K⁺‑АТФазы и Mg²⁺- и Ca²⁺-АТФазы у крыс [5]. Покрытие МНЧ – важный фактор, определяющий их биосовместимость [6]. По данным Gárate-Vélez L. и соавт., НЧ Fe₃O₄ могут взаимодействовать с микрососудистыми эндотелиальными клетками, образующими ГЭБ, и проникать через них, вызывая биологические повреждения [7]. Ранее проведён эксперимент [8] по подострому внутрижелудочному введению НК оксида железа, инкапсулированного в полимерную матрицу арабиногалактана (АГ). Содержание железа в препарате составляло 3,6%, размер наночастиц – 5–20 нм. В раннем периоде после воздействия НК оксида железа у крыс развивался периваскулярный отёк сосудов головного мозга, уменьшалось число нормальных нейронов на единицу площади, увеличивалось число нейронов с экспрессией стресс-белка теплового шока (БТШ) 70 [8]. Существуют данные о том, что неорганические НЧ могут быть нейротоксичными при накоплении в мозге [9, 10], однако отдалённые нейротоксические эффекты НЧ оксида железа остаются неизученными. Таким образом, исследования нейротоксических свойств вновь синтезированного НК оксида железа, инкапсулированного в природную матрицу АГ, являются актуальными.

Цель исследования – дать оценку нейротоксичности НК оксида железа, инкапсулированного в природную матрицу АГ, в динамике постконтактного периода по изменению показателей электроэнцефалографии (ЭЭГ) и поведенческих реакций у крыс.

Материалы и методы

Экспериментальные исследования выполняли в соответствии с Женевской конвенцией (1990 г.), директивой Совета Европейского сообщества (86/609/ЕЭС) от 24 ноября 1986 г., Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях (Страсбург, № 123 от 18.03.1986 г.), Хельсинкской декларацией о гуманном отношении к животным (Leuven, Belgium, от 19.10.2024 г.). На проведение экспериментов было получено разрешение локального этического комитета ФГБНУ «Восточно-Сибирский институт медико-экологических исследований» (заключение № 8 от 15.12.2023 г.). Работу выполняли на крысах, полученных из одного источника путём собственного воспроизводства в виварии. В течение всего эксперимента животные находились в стандартных условиях вивария при естественном освещении, влажность воздуха составляла 55–60%, температура воздуха – плюс 20 ± 2 °С. Крысы получали гранулированный комбикорм, обогащённый витаминами и биодобавками, в соответствии с требованиями к содержанию животных в вивариях, круглосуточно имели свободный доступ к поилкам с питьевой водой и корму.

Объектами исследования являлись беспородные половозрелые белые крысы-самцы, по 30 животных в каждый срок обследования (несвязанные выборки). Животные были распределены рандомным образом в группы по 10 особей. Крысы опытных групп получали НК оксида железа, инкапсулированный в природную полимерную матрицу АГ, интрагастрально в течение 10 дней, в дозах 500 мкг/кг (группы Fe₃O₄АГ 500) и 5000 мкг/кг массы тела (группы Fe₃O₄АГ 5000). Дозы НК были выбраны по результатам ранее проведённых исследований как действующие и способные вызывать выраженные и устойчивые изменения у крыс [11], 10-кратная доза выбрана согласно основам токсикологии. Особям контрольных групп внутрижелудочно вводили 0,5 мл 0,9%-го NaCl при аналогичных условиях. Животные были обследованы дважды: непосредственно после окончания экспозиции НК (1-й срок) и через 6 мес постконтактного периода (2-й срок).

Поведенческие реакции крыс изучали в тесте «открытое поле» сразу после завершения воздействия НК. Тестирование проводили на круглой арене диаметром 40 см, с полупрозрачным полом, стенами высотой 25 см и инвертированным освещением. Использовали системы трёхмерного слежения за животными EthoStudio (Россия). Крыс помещали возле стены и в течение 3 мин автоматически с помощью ПО оценивали общее пройдённое расстояние (м), время (%) нахождения животного в центральной части арены (время нахождения в центре выражалось в процентах от общего времени наблюдения) и площадь исследуемой арены (рассчитывалась как доля арены (%), посещаемая крысой), а количество актов фризинга (замирания животного более чем на 3 с) регистрировали вручную. С помощью редактора карт программы EthoStudio визуализировали активность животных во время тестирования в «открытом поле».

На следующие сутки после тестирования крыс в «открытом поле» выполняли регистрацию фоновой ЭЭГ длительностью 60 с прибором «Нейрон-Спектр-1/В» (ООО «Нейрософт», Россия) с подкожными стальными игольчатыми электродами длиной 15 мм. Запись ЭЭГ проводили с двух стандартных отведений Fp1-A1 (префронтального) и С3-А1 (центрального) соматосенсорных областей головного мозга. Референтный электрод фиксировали в области носовой пазухи, заземляющий электрод закрепляли на хвосте животного. Изучали среднюю амплитуду (мкВ), среднюю мощность (мкВ²), мощность спектров (индекс ритмов, %). Параметры фильтров высоких и низких частот – 0,5 и 35 Гц, частота квантования – 500 Гц. При анализе записи было включено автоматическое удаление артефактов. Изучали характеристики основных ритмов: дельта (Δ) (0,5–4 Гц), тета (θ) (4–8 Гц), альфа (α) (8–13 Гц), бета-1 (β1) (13–22 Гц) и бета-2 (β2) (22–32 Гц). Длительность эпох анализа была равна 10 с. Обработку, анализ ЭЭГ и формирование протоколов выполняли с применением программного обеспечения «Нейрон-Спектр-1/В» (ООО «Нейрософт», Россия). Первичные данные протоколов ЭЭГ обрабатывали с помощью пакета прикладных программ Statistica 6 for Windows. Статистическую обработку и анализ данных (несвязанные выборки) выполняли при помощи непараметрических методов с использованием критерия Манна – Уитни. Проверку нулевой гипотезы распределения данных проводили по критерию Шапиро – Уилка. Результаты представляли в виде медианы (Me) и интерквартильного интервала (Q₂₅–Q₇₅), различия между группами с учётом поправки Бонферрони считали значимыми при р < 0,017.

Результаты

Непосредственно после окончания воздействия НК у крыс в тесте «открытое поле» увеличивалась двигательная активность (табл. 1).

У животных в группе Fe₃O₄АГ 500 в виде тенденции (р = 0,045) увеличивался пройденный путь – компонент горизонтальной двигательной активности, а в группе Fe₃O₄АГ 5000 он возрастал статистически значимо (р = 0,009) по сравнению с контролем.

У особей в группе Fe₃O₄АГ 500 время нахождения в центре не изменилось ко 2-му сроку обследования, но было больше (р = 0,006) по сравнению с крысами контрольной группы, у которых данный показатель значительно снизился в постконтактном периоде. У животных группы Fe₃O₄АГ 5000 по сравнению с контрольными крысами наблюдалось уменьшение (р = 0,042) исследования площади арены и пройденного пути (р = 0,022), имеющее характер тенденции. В то же время во всех группах в отдалённом периоде отсутствовал акт вертикальной стойки. Вертикальная двигательная активность (мм) значимо не различалась у опытных и контрольных животных в оба срока, но у особей группы Fe₃O₄АГ 5000 к отдалённому сроку уменьшилось (р = 0,029) число стоек с упором по сравнению с данным показателем у интактных особей. У этих крыс происходило угнетение ориентировочно-исследовательской и горизонтальной двигательной активности. Эти признаки указывают на депрессивноподобное состояние животных опытных групп (см. табл. 1).

С помощью редактора карт программы EthoStudio установлены различия визуализации пространственного распределения животных в динамике эксперимента. Особи из опытных групп, подвергавшихся воздействию НК в дозах 500 и 5000 мкг/кг, демонстрировали более выраженную двигательную активность по сравнению с контрольными крысами, особенно в центральной и промежуточной части арены (рис. 1, см. на вклейке).

У крыс из опытных групп в отдалённом периоде обследования снижение общей двигательной активности подтверждала репрезентативная визуализация (рис. 2, см. на вклейке).

Нарушения поведения у крыс после воздействия НК связаны с нейрофизиологическими изменениями, регистрируемыми на ЭЭГ. У крыс-самцов в раннем периоде после окончания введения НК Fe₃O₄АГ в дозе 500 мкг/кг массы тела при анализе биоэлектрической активности головного мозга с префронтального отведения Fp1-A1 наблюдалось повышение средней амплитуды на уровне тенденции у дельта-ритмов (р = 0,041) и бета-1-ритмов (р = 0,041), а у альфа-ритма статистически значимое её возрастание (р = 0,009) по сравнению со средней амплитудой этих ритмов у контрольных животных (табл. 2). В отдалённом периоде в обеих опытных группах в префронтальном отведении Fp1-А1 снижалась средняя амплитуда дельта-ритма при р = 0,016 и при р = 0,009, тета-ритма при р = 0,004 и при р = 0,185 по сравнению с контрольной группой соответственно. Средняя амплитуда тета-ритма у крыс группы Fe₃O₄АГ 500 была статистически значимо ниже (р = 0,012) данного показателя у особей группы Fe₃O₄АГ 5000.

У особей группы Fe₃O₄АГ 500 средняя мощность медленноволнового диапазона дельта-ритма ЭЭГ в обоих отведениях возросла на уровне тенденции (р = 0,019) по сравнению с показателем контрольных крыс (табл. 3).

У этих же крыс в префронтальном отведении повысилась средняя мощность быстроволновых альфа- и бета-1-ритмов (р = 0,005 и р = 0,016 соответственно) по отношению к значениям контрольной группы. В то же время у крыс, получавших НК в дозе 5000 мкг/кг массы тела, не фиксировали статистически значимых изменений биоэлектрической активности головного мозга. У них наблюдали разнонаправленные результаты в виде тенденций (см. табл. 3).

У крыс опытной группы после воздействия НК в дозе 500 мкг/кг в префронтальном отведении Fp1-A1 установлено снижение значений мощности по индексу тета-ритма в виде тенденции (р = 0,023) по сравнению с показателями контрольной группы (табл. 4).

В раннем периоде наибольшие различия на ЭЭГ крыс при воздействии НК оксида железа в обеих дозах установлены в центральном отведении (С3-А1), выявлялись однонаправленные изменения: повышение мощности по индексу дельта-ритма (р = 0,004 и р = 0,003 соответственно), снижение мощности по индексу тета-ритма (р = 0,011 и р = 0,010 соответственно) и по индексу альфа-ритма (р = 0,007 и р = 0,001 соответственно) по сравнению с контрольной группой. Кроме того, у особей группы Fe₃O₄АГ 5000 в отведении С3-А1 наблюдалась тенденция к снижению мощности по индексу альфа-ритма по сравнению с крысами группы Fe₃O₄АГ 500 (р = 0,023). У животных группы Fe₃O₄АГ 500 в центральном отведении снижение мощности спектров по индексу бета-1-ритма имело характер тенденции по сравнению с интактными особями (p = 0,089) (см. табл. 4).

Обсуждение

В динамике постконтактного периода и в опытных, и в контрольных группах отмечали изменения горизонтальной и вертикальной двигательной активности. В раннем постконтактном периоде при тестировании в «открытом поле» выявлено увеличение локомоторной активности, более выраженное у животных группы Fe₃O₄АГ 5000, в виде возрастания пройденного пути, что указывало на преобладание процессов возбуждения [12]. В раннем периоде особи, получавшие НК в обеих дозах, дольше находились в центре арены по сравнению с контролем, это подобно поведению грызунов при воздействии препаратов с анксиолитическим эффектом. В отдалённом постконтактном периоде животные опытных групп исследовали лишь малую часть периферии арены «открытого поля» в отличие от поведения в ранний срок обследования и от контрольных особей в оба срока обследования. У крыс отдалённый период после введения НК характеризовался угнетением ориентировочно-исследовательской активности в виде более редких стоек с упором в группе Fe₃O₄АГ 5000 и уменьшением горизонтального компонента поведения, что демонстрировало депрессивноподобное состояние. Подобные результаты наблюдались в другом исследовании с использованием взрослых крыс линии Wistar, у которых подострое воздействие 20 мкг/кг НК TiO₂ приводило к повышению тревожности [13]. Минигалиевой И.А. и соавт. также были показаны угнетающие эффекты на поведение крыс при воздействии НК металлов [14].

Известно, что на изменения в поведении оказывают влияние фоновые биологические ритмы, стресс, новизна обстановки в тесте «открытого поля», сезонность, возраст животных. С возрастом у крыс снижается спонтанная двигательная и исследовательская активность, уменьшается общее пройденное расстояние, увеличиваются периоды неподвижности, усиливается прижимание к стене (поведение, подобное тревоге) из-за общих процессов старения [15]. Базовые параметры ЭЭГ могут существенно различаться у неродственных выборок из-за незначительных различий в условиях выращивания, содержания или старения циркадной системы. В нашем эксперименте обследование крыс в динамике длительного периода после воздействия НК оказывало влияние на результаты вариабельности параметров поведения и ЭЭГ.

Непосредственно после окончания введения НК оксида железа по результатам репрезентативной визуализации в EthoStudio животные опытных групп по сравнению с интактными особями демонстрировали значительное возрастание двигательной активности и резкое её уменьшение к отдалённому постконтактному периоду. НК Fe₃O₄АГ при подостром пероральном введении крысам-самцам в дозе 500 мкг/кг оказывал влияние на биоэлектрическую активность головного мозга, изменения которой выражались в раннем периоде как возрастание средней амплитуды и мощности дельта-, альфа- и бета-1-диапазонов, а также снижение амплитуды и мощности индекса спектра тета-ритма. Отсутствие дозозависимых изменений средней амплитуды альфа-ритма и средней мощности альфа- и бета-1-ритмов можно объяснить тем, что небольшая доза может выводить систему в оптимальный функциональный пик при наличии изменений. При этом большая доза может приводить к гиперстимуляции или к торможению и истощению систем регуляции, из-за чего параметры возвращаются к исходным значениям или маскируются в виде отсутствия эффекта. Результаты, когда меньшая доза вызывает изменения на ЭЭГ, а большая доза не даёт дозозависимого эффекта, часто встречаются в нейрофармакологии и физиологии. Это требует дальнейших исследований.

В отдалённом периоде выявлено уменьшение амплитуды и мощности спектра дельта-ритма, более значимое у животных, получивших НК в дозе 5000 мкг/кг. У этих же животных медленноволновая активность тета-ритма, оставаясь сниженной по сравнению с контрольной группой, была значимо выше, чем в группе Fe₃O₄АГ 500. В этой же группе произошло перераспределение ритмов с доминированием быстроволнового бета-1-ритма.

Таким образом, анализ ЭЭГ свидетельствует о дестабилизации биоэлектрической активности головного мозга крыс после введения НК Fe₃O₄АГ, которая сохранялась длительный период после воздействия. Полученные нами результаты согласуются с данными других исследователей, обнаруживших негативные эффекты воздействия НК на кору головного мозга на тканевом и клеточном уровнях. По мнению авторов [16], чем выше амплитуда медленноволнового тета-ритма, тем более выражен патологический процесс, который, согласно существующим представлениям, связан со структурными и функциональными изменениями головного мозга. Нарастание медленноволновой активности тета-ритма в отдалённом периоде, называемое стресс-ритмом, свидетельствует об эмоциональной нестабильности. Другими исследователями на фоне интраназального введения НЧ TiO₂ были зафиксированы выраженные изменения биоэлектрической активности нейронов префронтальной области коры головного мозга крыс в виде преобладания медленноволновой активности тета- и дельта-диапазонов, сопряжённого с уменьшением относительной мощности ритмов альфа-, бета-1, бета-2. Авторы предполагают возможное развитие нейродегенеративных изменений в изучаемой области коры головного мозга [17]. По данным [18], отмечено токсическое действие водной суспензии НЧ Fe₃O₄ после внутрибрюшинного введения в дозе 500 мг/кг 3 раза в неделю в течение 5 дней. Авторы обнаружили, что при равных массовых дозах НЧ Fe₃O₄ обладают значительно более высокой системной токсичностью по сравнению с микрочастицами. Однако в нанометровом диапазоне связь между размером частиц и резорбтивной токсичностью сложна и неоднозначна, что можно объяснить различиями в токсикокинетике различных НЧ, которая определяется как более или менее существенным прямым проникновением НЧ через биологические барьеры, так и их неодинаковой растворимостью. Нарушения функциональной активности головного мозга у крыс в группах Fe₃O₄АГ 500 и Fe₃O₄АГ 5000 могут быть связаны с митохондриальной дисфункцией, вызываемой НК оксида железа, в клетках головного мозга. Морфотипический состав митохондрий показал существенные изменения после интраназальной экспозиции НЧ оксида железа (III): доля митохондрий с нормальным и везикулярно набухшим морфотипами снизилась по сравнению с контрольной группой животных, доля митохондрий нормально-везикулярного и везикулярного морфотипов повысилась, и доля везикулярно набухших митохондрий снизилась [19]. Изменения ЭЭГ у крыс после воздействия НЧ оксида железа, вероятно, опосредованы их влиянием на функцию эндотелия сосудов головного мозга. Tyumentseva A. и соавт. доказали, что НЧ в концентрациях 100 и 200 мг/л вызывают изменение метаболизма в клетках-компонентах ГЭБ – эндотелиоцитах и подлежащих астроцитах [20]. Другие исследователи показали развитие апоптоза при введении МНЧ оксидов железа крысам [21], нарушение краткосрочной и долгосрочной памяти пассивного избегания, снижение уровня дофамина и повышение серотонина в гиппокампе в зависимости от дозы [22], выявили признаки дегенерации нейронов в коре головного мозга [23].

Заключение

При пероральном введении крысам-самцам НК оксида железа, инкапсулированного в матрицу АГ, в дозах 500 и 5000 мкг/кг установлены изменения поведенческой активности и ЭЭГ, не позволяющие сделать однозначные выводы о дозозависимой нейротоксичности. В тесте «открытого поля» у особей увеличение локомоторной активности сразу после окончания экспозиции НК сменялось её снижением в отдалённом периоде, а также уменьшением вертикальной исследовательской активности по сравнению с контрольными животными. В ранний срок после воздействия Fe₃O₄АГ в обеих дозах выявлены однонаправленные эффекты: возрастание средней мощности по индексу дельта-активности и её снижение по индексам тета- и альфа-ритмов по сравнению с контрольными показателями, которые были обратимыми в динамике отдалённого периода. Требуется дальнейшее изучение нейротоксических эффектов НК металлов, в том числе для обоснования дозозависимых изменений в центральной нервной системе.