Отдалённые последствия острой интоксикации торфяным дымом в период полового созревания в эксперименте на животных

Введение

Многие эпидемиологические исследования последних лет посвящены влиянию дыма природных пожаров (ПП) на здоровье людей. Значительная часть этих исследований охватывает все возрастные категории [1], но мало внимания уделяется группам населения с повышенной уязвимостью, в том числе детям и подросткам [2, 3]. Дети и подростки особенно чувствительны к загрязнению воздуха из-за повышенной частоты дыхания, большей скорости нейронных изменений и продолжительности времени, проводимого на открытом воздухе [4]. Дети в отличие от взрослых имеют менее эффективную назальную фильтрацию, поэтому в их лёгкие может проникать большее количество твёрдых частиц [5]. Воздействие дыма ПП традиционно связывают с неблагоприятными последствиями для сердечно-сосудистой и респираторной систем, в то время как нейротоксический профиль продуктов горения биомассы изучен недостаточно. Поскольку структура и функции мозга человека продолжают созревать вплоть до 30 лет [6], нейротоксическое влияние дыма может проявляться на протяжении всего динамического процесса нейроразвития в результате воздействия в детстве или в подростковом периоде [7]. Отдалённые последствия нарушений здоровья при воздействии дыма ПП на детей и подростков в настоящее время неизвестны [8]. В связи с этим целью настоящего исследования была оценка отдалённых последствий у белых крыс обоего пола после однократной экспозиции торфяным дымом в период полового созревания.

Материалы и методы

В качестве источника биомассы использовали пробы торфа, отобранные на месте осушенных торфяных болот в Ангарском районе. Животных подвергали однократному воздействию дыма в течение четырёх часов с помощью ранее разработанного устройства для моделирования интоксикации продуктами горения биомассы у мелких лабораторных животных [9]. Для контроля воздушной среды в экспозиционной камере каждый час с помощью газоанализатора ГАНК-4 (НПО «Прибор», Россия) определяли концентрации оксида углерода (СО), диоксида углерода (СО₂), кислорода (О₂). Концентрацию твёрдых частиц размером менее 2,5 мкм (PM_2,5) измеряли пылевым анализатором DustTrak 8533 (TSI Incorporated, США). Температуру воздуха и относительную влажность в экспозиционных камерах поддерживали в диапазонах плюс 24–25 °С и 40–50% соответственно. Животным контрольной группы (10 самцов, 10 самок) в камеру подавали чистый воздух. Критериями уровня задымления были концентрации РМ_2,5 и СО. Целевые значения концентраций твёрдых частиц находились в диапазоне, зарегистрированном в атмосферном воздухе во время торфяных пожаров [10, 11]. С помощью программы MPPD (Multiple Path Particle Dosimetry V3.04) оценивали общее осаждение частиц, осаждение в верхних дыхательных путях, трахеобронхиальной и альвеолярной зонах лёгких белых крыс с использованием модели Semi-symmetric Long-Evans (полусимметричная модель дыхательных путей лёгких крысы) [12].

Экспозицию торфяным дымом проводили в период полового созревания – на 35-й день жизни (Р35) для самок белых крыс (n = 10) и на 45-й день (Р45) для самцов (n = 10). Выбор данных периодов воздействия обусловлен тем, что у белых крыс половое созревание происходит между P30 и P42 у самок и P42 и P55 у самцов, при этом регулярные эстральные циклы и наличие зрелых сперматозоидов в семявыносящих протоках являются показателями завершения этой стадии развития у самок и самцов соответственно [13].

Оценку отдалённых последствий интоксикации крыс торфяным дымом проводили в возрасте трёх месяцев (период половозрелости). Анализировали показатели поведения в тесте «открытое поле», результаты электроэнцефалографии (ЭЭГ), выполняли забор крови для оценки уровня фрагментации ДНК и гистологическое исследование нервной ткани и ткани семенников. Тестирование в «открытом поле» проводили в течение трёх минут с использованием АПК EthoStudio (Россия) [14] с автоматической регистрацией исследованной площади, времени нахождения животного в центре, вертикальной активности и пройдённого пути. ЭЭГ выполняли с помощью подкожных игольчатых электродов с использованием электроэнцефалографа «Нейрон-Спектр-1/В» (Нейрософт, Россия) по ранее описанной методике [15]. Для оценки уровня фрагментации ДНК кровь отбирали из хвостовой вены через сутки после окончания затравки. Особям группы позитивного контроля (n = 5) вводили метилметансульфонат в дозе 40 мг/кг внутрибрюшинно однократно за 24 ч до забоя. Условия проведения щелочного гель-электрофореза и визуализации полученных изображений описаны нами ранее [15]. Выведение животных из эксперимента осуществляли методом декапитации, после чего производили забор головного мозга и семенников для гистологических исследований. Материалом для микроскопического исследования служили сенсомоторная зона коры головного мозга и сперматогенный эпителий, из которых изготавливали послойные серийные срезы толщиной 5 мкм. В препаратах, окрашенных гематоксилином и эозином, подсчитывали следующие показатели: в ткани мозга – число дегенеративно изменённых нейронов и число актов нейронофагии; в ткани семенника – индекс сперматогенеза, количество семенных канальцев.

Статистический анализ результатов исследования выполняли с помощью пакета прикладных программ Statistiсa 6.1. (StatSoft) (лицензия № AXXR004E642326FA). Предварительно был проведён анализ полученных данных для определения вида распределения (W-критерий Шапиро – Уилка). Для сравнения групп применяли U-критерий Манна – Уитни. Нулевые гипотезы об отсутствии различий между группами отвергали при достигнутом уровне значимости р ≤ 0,05. Результаты представлены в виде медианы и интерквартильного размаха Ме (Q₂₅; Q₇₅).

Результаты

Использование разработанной нами ранее экспериментальной модели торфяного пожара позволило создать в затравочной камере задымление, близкое к натурным условиям. На рис. 1 (см. на вклейке) представлены результаты замеров проб воздуха в камере при моделировании пожарной эмиссии. Средние концентрации СО и РМ_2,5 в экспозиционных камерах составили 29,3 ± 11,1 и 0,39 ± 0,61 мг/м³ соответственно и характеризовались достаточно высоким уровнем вариабельности. Наблюдаемые величины превышают ПДК_м.р. в атмосферном воздухе по содержанию СО в 6 раз, по содержанию РМ_2,5 – в 2,4 раза. При этом содержание СО₂ не превышало 0,62 ± 0,16 об.%, а концентрация кислорода находилась в пределах 19,1 ± 0,2%. Уровень воздействия торфяного дыма по содержанию СО и РМ_2,5 в настоящем исследовании соотносится с данными о загрязнении воздуха в населённых пунктах, пострадавших от дыма ПП [10, 11]. В исследованиях Reinhardt (2004) было показано, что содержание оксида углерода коррелирует с основными компонентами дыма от сжигания биомассы, такими как акролеин, бензол, формальдегид и респирабельные твёрдые частицы, что позволяет считать его количественным индикатором воздействия дыма [16]. Вместе с тем в большинстве исследований, посвящённых изучению влияния дыма ПП на здоровье человека, основным критерием загрязнения воздуха считают содержание РМ_2,5 [17].

Осаждаемая фракция частиц РМ_2,5, рассчитанная для белых крыс моделью MPPD, в условиях данной экспозиции составила 93,4% для верхних дыхательных путей, 3,67% для трахеобронхиальной зоны и 1,67% для альвеолярной зоны. По данным компьютерного моделирования, у крыс скорость осаждения РМ_2,5 в носовой полости, носоглотке, носоглоточных путях значительно превышает таковую в других отделах лёгких и при концентрации РМ_2,5 на уровне 0,39 мг/м³ составляет 6,73E–03 мкг/мин, в зоне трахеи, бронхов и бронхиол – 1,37E–04 мкг/мин, в зоне альвеол – 4,41E–07 мкг/мин. С учётом полученных данных нами рассчитана депонированная доза РМ_2,5 на единицу площади у крыс за время экспозиции длительностью 4 ч, составившая в трахеобронхиальной и альвеолярной зонах дыхательных путей 33 и 0,106 нг/см² соответственно. На основании расчётов за время экспозиции осели в верхних дыхательных путях белых крыс 1,62 мкг/см² частиц РМ_2,5.

При анализе полученных результатов тестирования в «открытом поле» белых крыс, подвергавшихся воздействию торфяного дыма, выявлено снижение двигательной активности у экспонированных животных обоего пола, о чём свидетельствовало уменьшение пути, пройденного самцами и самками (p = 0,0018 и р = 0,0024 соответственно). Данные представлены в табл. 1. Последствием экспозиции торфяным дымом было также значительное угнетение исследовательской активности белых крыс, проявлявшееся снижением количества вертикальных стоек у самцов и самок по сравнению с контролем (p = 0,027 и р = 0,003 соответственно; см. табл. 1).

Результаты ЭЭГ половозрелых самцов белых крыс, подвергавшихся воздействию торфяного дыма в период полового созревания, не показали статистически значимых отличий от контроля (табл. 2). ЭЭГ самок характеризовалась статистически значимым снижением (р = 0,048) средней амплитуды β2-ритма на 38% по сравнению с показателями контрольной группы (см. табл. 2). Спектральный анализ показал статистически значимое повышение индекса δ-ритма у самок в 2,1 раза (р = 0,023) и тенденцию к снижению индекса β2-ритма (р = 0,074) по сравнению с контролем.

При гистологическом исследовании ткани сенсомоторной коры головного мозга животных, подвергавшихся однократному воздействию торфяного дыма в период полового созревания, не выявлено значительных нарушений. Кровенаполнение сосудов вещества мозга у всех животных было в норме, изменений сосудистых стенок и оболочек не выявлено. При морфометрическом анализе дегенеративно изменённых нейронов, а также определении числа актов нейронофагии не выявлено статистически значимых отличий от показателей контрольной группы (рис. 2, см. на вклейке).

При макроскопическом исследовании семенников половозрелых белых крыс, подвергавшихся однократному воздействию торфяного дыма в период полового созревания, наблюдалось умеренное кровенаполнение, не отличающееся от нормы. Нарушений реологии крови выявлено не было. Сосудистые стенки не изменены, кровоизлияний не обнаружено. Извитые канальцы нормального размера, просветы в норме. Собственная оболочка различается по всей поверхности, без утолщений и разрывов. По результатам морфометрического исследования основных функциональных показателей деятельности семенников белых крыс, подвергавшихся воздействию торфяного дыма, статистически значимые отличия от контрольной группы не выявлены (рис. 3, см. на вклейке).

Уровень фрагментации ДНК в лейкоцитах самцов и самок белых крыс, подвергавшихся воздействию торфяного дыма в период полового созревания, по достижении ими половозрелого возраста составил 3,4 (2,6; 4,2) и 1,6 (1,3; 5,2)% соответственно, в то время как в контрольной группе данный показатель составил 3,8 (3; 4,7) и 5 (4,8; 5,1)% соответственно (р = 0,54 и р = 0,38). Повреждённость ДНК клеток крови у особей группы позитивного контроля в данном эксперименте составила 28,3 (19,6–39,8)%, что свидетельствовало об объективности эксперимента. Во всех исследуемых группах белых крыс незначительное повреждение ДНК (до 10%) в лейкоцитах или его отсутствие наблюдалось в 93–95% клеток. Клетки со значительными повреждениями (от 10 до 30% повреждённой ДНК) обнаружены у опытных самцов и самок (от 5–6%), при этом статистически значимых отличий от группы контроля (6–11%) выявлено не было. Количество апоптоз-положительных клеток во всех изученных группах животных не превышало 2%.

Обсуждение

Воздействие дыма ПП неизменно ассоциируется с повышенным риском неблагоприятных последствий для здоровья детей и подростков, преимущественно со значительным увеличением числа обращений в отделения неотложной помощи по причине респираторных патологий и госпитализаций при обострении астмы [18]. В большинстве исследований доказана связь респираторной патологии с содержанием в воздухе твёрдых частиц, в основном с РМ_2,5, в условиях задымления. Проведённое исследование направлено на оценку отдалённых последствий воздействия дыма ПП для ЦНС и репродуктивной системы при моделировании условий, близких к натурным по содержанию РМ_2,5 и СО. Использование модели MPPD позволило оценить осаждение аэрозоля РМ_2,5 в дыхательных путях белых крыс за всё время экспозиции. По результатам компьютерного моделирования при концентрации РМ_2,5 на уровне 0,39 мг/м³ у крыс значительная часть аэрозоля депонируется в верхних дыхательных путях, составляя 93,4% от общей фракции, в то время как у взрослого человека данный показатель составляет 29,9%, у подростка – 25–26%. Депонированная доза РМ_2,5 в трахеобронхиальной и альвеолярной зонах дыхательных путей белых крыс составила 33 и 0,106 нг/см² соответственно, то есть 5,3% от общей массы осевших частиц в дыхательных путях. В связи с этим экстраполяция на человека респираторных эффектов, наблюдаемых у крыс и ассоциированных с воздействием только РМ_2,5, может быть затруднительна.

У белых крыс нейротоксическое действие РМ_2,5 в составе дыма ПП может проявляться в значительной степени из-за особенностей процесса дыхания (крысы относятся к облигатно дышащим) и миграции токсичных компонентов с поверхности твёрдых частиц по обонятельным нервам непосредственно в обонятельные луковицы, а затем в глубокие отделы мозга (гиппокамп, кору) [19]. В настоящем исследовании однократное воздействие торфяного дыма в период полового созревания привело к изменению структуры поведения и показателей ЭЭГ взрослых особей при сохранении нормальной гистологической картины ткани сенсомоторной коры головного мозга. Самцы и самки белых крыс в половозрелом возрасте демонстрировали однонаправленные изменения показателей поведения, выражавшиеся в снижении горизонтальной и вертикальной активности. Следует отметить, что нейрофизиологические показатели ЭЭГ были изменены только у самок крыс, подвергавшихся воздействию торфяного дыма в подростковом возрасте.

Вероятно, в основе выявленных у крыс этологических нарушений лежат функциональные изменения ЦНС, связанные в первую очередь с процессами нейровоспаления и нейромедиаторного обмена. Данное предположение подтверждается исследованиями Scieszka D. и соавт., которые показали, что воздействие твёрдых частиц дыма лесных пожаров в течение 20 дней вызывает устойчивые функциональные нарушения ЦНС у самцов мышей (нейровоспаление, метаболический сдвиг, проагрегантный статус Aβ), которые происходят при сохранной макро- и микроструктуре ткани головного мозга, но являются достаточными для формирования серьёзных этологических нарушений и долгосрочного риска нейродегенерации [20].

Возможно, воздействие торфяного дыма в период полового созревания, когда непрерывно протекают процессы совершенствования и созревания нейронных цепей, изменяет синаптическую пластичность и потенциально способствует развитию депрессивного поведения. Хотя в рамках данного исследования не были использованы классические тесты, позволяющие оценить степень депрессивноподобного поведения у белых крыс, мы можем предположить его наличие по значительному снижению двигательной (на 24–31%) и исследовательской (на 26–31%) активности в тесте «открытое поле». Данный тест базируется на оценке тревожности, которая является одним из наиболее распространённых симптомов депрессии. При исключении моторного дефицита низкий уровень локомоций и ориентировочно-исследовательского поведения является надёжным критерием депрессивноподобного состояния [21]. Связь между воздействием PM_2,5 атмосферного воздуха и развитием депрессии у крыс описана в работе Kim H.J. и соавт., в которой показано, что интраназальное введение РМ_2,5 белым крысам в течение 28 дней вызывает депрессивноподобное поведение через пути стресса эндоплазматического ретикулума и окислительного стресса в гипоталамусе, приводя к дофаминергической дисфункции [22]. В литературе также есть данные о роли РМ_2,5 в развитии болезней аутистического спектра [23]. Так, отдалённые эффекты РМ_2,5 описаны в работе Li K. и соавт. Авторы обнаружили, что при воздействии PM_2,5 в ранний неонатальный период в течение двух недель крысы проявляли типичные поведенческие признаки аутизма, в том числе нарушения коммуникации, плохое социальное взаимодействие и избегание новизны [24].

Имеющиеся в современной литературе данные свидетельствуют о том, что ПП оказывают негативное влияние на психическое здоровье жителей пострадавших районов, часто приводя к снижению психологической адаптации и общего благополучия [25]. Исследование, проведённое в отдалённом периоде после масштабного ПП (через 18 мес) в Канаде, сопровождавшегося эвакуацией целого города, показало, что симптомы у 37% учащихся 7–12-х классов соответствовали критериям посттравматического стрессового расстройства (ПТСР), 31% – клинически значимой депрессии, а 17% – критериям депрессии как минимум средней степени тяжести [26]. С учётом значительного влияния таких психосоциальных факторов в условиях ПП, как фактическая близость к месту пожара, объективная угроза жизни и имуществу, невозможно определить роль загрязнения воздуха продуктами горения в развитии нарушений психического здоровья без проведения специализированных экспериментальных исследований. Растущая активность ПП и увеличение числа населённых пунктов вблизи зон риска определяют важность разработки стратегий снижения последствий и формирования адаптации, направленных на минимизацию негативного воздействия выбросов от лесных пожаров на здоровье уязвимых групп населения, в том числе детей и подростков.

При исследовании клеток крови методом ДНК-комет статистически значимых изменений фрагментации ДНК белых крыс после воздействия торфяного дыма в подростковом возрасте не выявлено. Полученные данные могут свидетельствовать как о высокой эффективности процессов репарации ДНК у белых крыс в данные периоды жизни, так и о том, что повреждение ДНК не является доминирующим механизмом токсичности торфяного дыма в рамках данной экспериментальной модели.

Особый интерес представляет влияние дыма ПП на репродуктивную систему. В нашем исследовании у взрослых половозрелых самцов белых крыс не было выявлено гонадотоксического эффекта после острой экспозиции торфяным дымом в подростковом возрасте. Однако результаты современных эпидемиологических исследований свидетельствуют о связи между воздействием дыма ПП и повышенным риском мужского бесплодия у пожарных [27, 28], что предполагает высокую уязвимость мужской репродуктивной системы к воздействию дыма ПП. Анализ клинических и экспериментальных данных позволяет предположить, что существует временной порог, разграничивающий функциональные нарушения (подвижность сперматозоидов) и структурные (индекс сперматогенеза): на начальных этапах или при невысокой интенсивности задымления страдает в первую очередь функция семенников, в то время как структурная целостность сперматогенного эпителия может оставаться сохранной. Кроме того, можно предположить, что воздействие дыма повреждает популяцию зрелых клеток, снижая общую подвижность в эякуляте, в то время как пул сперматогоний (стволовых клеток) остаётся нетронутым, что сохраняет нормальный индекс сперматогенеза. В настоящем исследовании не проводилась оценка функционального состояния сперматогенного эпителия, однако предыдущие исследования свидетельствовали о нарушении постнатального развития потомства первого поколения, полученного от самцов, затравленных торфяным дымом в аналогичном режиме [29]. Известно, что период полового созревания характеризуется активным эпигенетическим ремоделированием [30]. Воздействие токсических веществ в данный период может оказать влияние на экспрессию генов, определяющих функцию репродуктивной системы на протяжении всей последующей жизни. Поэтому мы предполагаем, что репротоксический эффект острого воздействия торфяного дыма в период полового созревания может быть связан как со снижением качества спермы белых крыс, так и с изменением эпигенетического статуса сперматозоидов.

Соблюдение этических стандартов. Исследование одобрено локальным этическим комитетом ФГБНУ ВСИМЭИ (протокол № 7 от 15.12.2023 г.), проведено в соответствии с Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях (ETS N 123), директивой Европейского парламента и Совета Европейского союза 2010/63/EC от 22.09.2010 г. о защите животных, использующихся для научных целей.

Ограничения исследования. Данное исследование ограничено изучением отдалённых последствий однократного воздействия торфяного дыма для ЦНС и репродуктивной системы белых крыс в период полового созревания.

Заключение

Полученные результаты подчёркивают необходимость дальнейших исследований влияния дыма ПП на нервную и репродуктивную системы, что особенно актуально в условиях прогнозируемого увеличения частоты и масштабов ПП при изменении климата. Отдалённые последствия нахождения на задымлённой ПП территории, в том числе в удалённых от очагов возгорания населённых пунктах, в настоящее время в должной мере не изучены и не оценены, особенно это касается уязвимых категорий населения. Подростковый возраст является одним из наиболее уязвимых периодов, и последствия воздействия экотоксикантов могут быть необратимыми и проявляться спустя десятилетия во взрослом возрасте.