Связь полиморфизма гена GSTP1 и его экспрессии с содержанием гемоглобина в крови работников производства по переработке свинца

Введение

Сохранение здоровья работающих граждан – одно из приоритетных направлений политики Российской Федерации. Известно, что на предприятиях по производству свинца условия труда сопряжены с воздействием различных вредных химических веществ (Pb, Zn, Cd, Cu, As, Sb и др.), содержащихся в воздухе рабочей зоны и влияющих на состояние здоровья работников, что может приводить к развитию болезней [1, 2]. Поэтому актуальной задачей является поиск надёжных биомаркёров, особенно на молекулярном уровне, для своевременного предотвращения негативных последствий и прогнозирования рисков.

К основным механизмам токсического действия ксенобиотиков относится их способность генерировать активные формы кислорода (АФК), избыток которых приводит к окислительному стрессу, вызывающему нарушения многих биохимических процессов и оказывающему негативное воздействие на кровеносную систему [3, 4]. Эритроциты постоянно подвергаются влиянию различных стрессовых факторов, которые приводят к необратимым повреждениям и гибели клеток. Таким образом, антиоксидантная система, способная инактивировать АФК и ликвидировать нанесённые ими повреждения, выполняет важную роль в защите данного типа клеток. Значительную часть этой системы составляет глутатион, основной низкомолекулярный тиол эритроцитов, который защищает белки от окисления [5]. Глутатион-S-трансфераза класса пи (GSTP1-1) присутствует во многих тканях млекопитающих и является наиболее распространённым внутриэритроцитарным изоферментом, составляющим 95% всего пула глутатион-S-транфераз [6]. Известно, что полиморфизм rs1695 гена GSTP1 приводит к снижению ферментативной активности белка, что потенциально ухудшает способность к детоксикации соединений [7]. Ранее была описана связь данного полиморфного варианта с развитием многих болезней, прямо или косвенно связанных с окислительным стрессом [8]. Предположительно, этот фермент является индуцируемым (его экспрессия модулируется уровнями токсической нагрузки), и, следовательно, экспрессия данного гена представляет собой возможный биомаркёр эффекта при заболеваниях, связанных с дисфункцией таких органов, как печень и почки [9]. Однако связь данного гена с уровнем гемоглобина в крови работников, подвергающихся вредным производственным факторам, ранее не была исследована.

Цель исследования – изучение влияния полиморфизма гена GSTP1 и его экспрессии на содержание гемоглобина в крови у работников производства по переработке свинца из вторичного сырья.

Материалы и методы

Исследование проводилось на базе ФБУН ЕМНЦ ПОЗРПП в рамках периодического медицинского осмотра (ПМО) в 2022 г. Для исследования связи полиморфизма rs1695 гена GSTP1 и уровнем гемоглобина в крови была сформирована выборка из работников предприятия по производству и переработке свинца из вторичного сырья. Обследованы 329 мужчин из следующих структурных подразделений: административное (16), ремонтно-механический цех (80), энергоцех (30), транспортный цех (27), металлургический цех (61), отделение рафинирования металлургического (плавильного) цеха (68), отделение свинца чернового металлургического (плавильного) цеха (47). Возраст мужчин – от 25 до 66 лет (средний возраст – 44,091 ± 9,301 года).

В исследование включали работников на основании следующих критериев: мужской пол; информированное добровольное письменное согласие на клинико-лабораторное обследование; общий стаж работы более 5 лет; отсутствие профессиональных установленных болезней; отсутствие обострения хронических болезней.

Показатели уровня гемоглобина (стандартная методика с использованием гематологического анализатора) в крови были взяты из карт ПМО, который проводится на базе ФБУН ЕМНЦ ПОЗРПП, за 2017–2022 гг.

Определение полиморфизма гена GSTP1 (rs1695). Выделение ДНК из образцов цельной крови проводили солевым методом по стандартной методике. Концентрацию и чистоту выделенной ДНК определяли с использованием спектрофотометра NanoDrop-ONE (Thermo Fisher Scientific, США). Амплификацию проводили в режиме реального времени с зондами и праймерами, представленными в табл. 1.

После обработки первичных данных для каждого образца был определён один из генотипов: A/A; A/G – нормальный гомозиготный или гетерозиготный варианты; G/G – мутантная гомозигота, снижение функционального продукта гена.

Определение уровня экспрессии гена GSTP1. Для определения экспрессии гена GSTP1 на основании полученных данных по полиморфизму rs1695 была сформирована выборка из 54 мужчин (плавильщики отделения рафинирования, группа Р). В качестве группы сравнения были выбраны 16 мужчин из административного подразделения (группа К), которые в отличие от плавильщиков не подвергались воздействию вредных производственных факторов.

Тотальную РНК из образцов венозной крови выделяли с использованием реагента ExtractRNA согласно протоколу производителя. Концентрацию и чистоту выделенной РНК определяли с использованием спектрофотометра NanoDrop-ONE (Thermo Fisher Scientific, США). Обратную транскрипцию проводили с использованием набора реактивов MMLV-RH («Диаэм», Россия) в соответствии с инструкциями производителя в амплификаторе Bio-Rad Т100 (Bio-Rad Laboratories, США). Амплификацию выполняли в режиме реального времени с использованием SYBR Green на амплификаторе QuantStudio 3 (Thermo Fisher Scientific, США). Прямой и обратный праймеры представлены в табл. 2.

Данные амплификации анализировали методом 2^–ΔΔCt, который показывает, во сколько раз изменяется экспрессия гена GSTP1. В качестве внутреннего контроля использовали ген GAPDH.

Статистический анализ. Нормальность распределения выборочных данных проверяли по критерию Колмогорова – Смирнова. Для статистической обработки экспериментальных данных использовали критерий Вилкоксона, а также критерий Краскела – Уоллиса и непараметрический U-критерий Манна – Уитни для сравнения двух независимых групп в программе Statistica (StatSoft, США). Результаты считали достоверными при p < 0,05.

Результаты

Исследование выявило у 329 работников производства переработки свинца из вторичного сырья изменение уровня гемоглобина в крови за 2017–2022 гг. (рис. 1), которое может быть связано с разными объёмами производства на данном предприятии и, следовательно, с различной экспозицией работников вредными факторами.

Анализ влияния генотипа GSTP1 на уровень гемоглобина у работников различных подразделений продемонстрировал, что мутантный генотип (G/G) связан с более низкими уровнями гемоглобина в крови именно у работников отделения рафинирования, большую часть которых составляют рафинировщики. Уровень гемоглобина был значительно ниже у носителей мутантного генотипа в 2018–2020 гг. (р = 0,021; р = 0,043; р = 0,0001 соответственно) (рис. 2).

Проведённое исследование уровня экспрессии гена GSTP1 у работников отделения рафинирования (рафинировщиков) и группы сравнения в 2022 г. выявило, что уровень экспрессии был статистически значимо ниже у экспонированной группы работников (p = 0,0178) (рис. 3).

Обсуждение

В данном исследовании была впервые показана связь генотипа GSTP1 с уровнем гемоглобина в крови у работников, подвергающихся вредным производственным факторам. Так, носительство мутантного (G/G) генотипа GSTP1 у работников отделения рафинирования было связано с более низкими показателями уровня гемоглобина. Вероятно, это обусловлено механизмом токсического действия различных загрязнителей воздуха рабочей зоны, в том числе свинца, посредством образования АФК, избыток которых приводит к окислительному стрессу, а также ингибированием различных ключевых ферментов синтеза гемоглобина [8]. В связи с этим можно выдвинуть предположение, что данная мутация может являться биомаркёром восприимчивости работников к вредным факторам производства свинца из вторичного сырья

Также была установлена более низкая экспрессия гена GSTP1 у экспонированной группы работников, что согласуется с данными других исследований [9]. Ansari G.A. с соавт. [10] показали, что ксенобиотики ингибируют GSTP1 в эритроцитах, следовательно, химическое воздействие приводит к снижению способности e-GST детоксицировать ксенобиотики. Из полученных нами результатов следует, что у работников наряду с генетической предрасположенностью при высокой токсической нагрузке происходит дополнительное ингибирование процессов детоксикации на уровне экспрессии генов, что требует внимания при составлении полной картины состояния здоровья и прогнозировании рисков.

Ограничения исследования. Не учитывалась этническая принадлежность обследуемых лиц.

Заключение

В исследовании была установлена связь полиморфизма гена GSTP1 с уровнем гемоглобина в крови у работников отделения рафинирования (рафинировщиков) производства свинца из вторичного сырья. Также было обнаружено снижение уровня экспрессии гена GSTP1 в крови работников, подвергающихся вредному воздействию, что говорит о дополнительном ингибировании процессов детоксикации на уровне экспрессии генов.

Полученные данные можно использовать как основу для составления полной картины состояния здоровья, прогнозирования рисков и организации медико-профилактических мероприятий.