Дезинвазия водных взвесей яиц гельминтов и цист кишечных простейших сверхвысокочастотным излучателем

Введение

Ежегодно, по данным Всемирной организации здравоохранения, в мире регистрируется 100 млн новых случаев паразитарных инвазий, из них ≈ 2 млн – в нашей стране [1]. В структуре заболеваемости населения Российской Федерации паразитозы (гельминтозы и протозоозы) составляют 8,1% [2], наиболее распространены энтеробиоз и описторхоз. Для контактных паразитозов (например, энтеробиоз) факторами передачи являются предметы обихода, для биогельминтозов (например, описторхоз) – пищевые продукты, заражённые возбудителями через фекалии больного человека с участием промежуточных хозяев. Эффективная и нетрудоёмкая дезинвазия факторов передачи паразитарных возбудителей в окружающей и бытовой среде – актуальная задача дезинфектологии, особенно когда речь идёт о домашних очагах и обеспечении санитарно-противоэпидемического режима в медицинских организациях и организованных коллективах. Для паразитарных возбудителей в зависимости от объекта используются различные методы дезинвазии. Способы оценки эффективности дезинвазии (овоцидной и протистоцидной активности) различных дезинфицирующих средств представлены в нормативном документе МУК 4.2.2661–10 «Методы санитарно-паразитологических исследований». Они предусматривают расчёт оптимальных эффективных концентраций и времени экспозиции химических веществ. Это не вполне применимо для оценки эффективности дезинвазии при воздействии физических факторов.

На современном этапе основными методами обеззараживания медицинских, лабораторных и иных отходов являются физический (автоклавирование, СВЧ-облучение) и химический [3]. В изученных авторами публикациях проблема дезинвазии объектов внешней среды физическими способами отражена незначительно, большинство работ посвящено химическим способам [4–7]. Существуют исследования, направленные на изучение альтернативного способа физической дезинфекции – СВЧ-облучения, однако в основном в отношении бактериальных агентов [8–10]. Отчасти это объясняется отсутствием отдельного способа оценки эффективности овоцидного и протистоцидного действия физических факторов. Также причиной может быть трудоёмкость паразитологической оценки жизнеспособности паразитарных возбудителей и сложность их накопления для масштабных экспериментальных исследований.

Обеззараживание медицинских отходов при помощи сверхвысокочастотного (СВЧ) излучения в последнее время получает всё большее распространение за счёт удобства эксплуатации и небольших затрат на обслуживание оборудования, однако оценка эффективности дезинвазии с применением такой методики требует корректировки для возбудителей паразитарных болезней.

Цель исследования – оценка эффективности обеззараживания стандартного режима СВЧ-излучателя в отношении инвазионных стадий возбудителей паразитозов, контаминирующих объекты окружающей среды, и корректировка методики оценки эффективности дезинвазии для физических факторов.

Материалы и методы

Экспериментальные исследования проведены в отделении паразитологических исследований микробиологической лаборатории, имеющей лицензию на работу с ПБА III–IV групп патогенности.

Возбудители паразитозов, использованные в эксперименте, получены от пациентов, исследованы и идентифицированы до биологического вида согласно МУК 4.2.3145–13 «Лабораторная диагностика гельминтозов и протозоозов».

Непосредственно для исследования использовали водные взвеси яиц Enterobius vermicularis и Dibothriocephalus latus (Diphyllobothrium latum), полученных из свежих половозрелых особей, и водные взвеси цист Entamoeba coli и яиц Opisthorchis felineus, полученных путём седиментационного обогащения из свежих фекалий пациентов. Взвеси яиц (цист) содержали также примеси органических веществ как погрешность очистки первичных биоматериалов. Систематизированная информация представлена в табл. 1.

Готовые взвеси яиц (цист) возбудителей паразитозов после тщательного многократного перемешивания дозатором во избежание осаждения быстро распределяли на три термоустойчивые пробирки по 1 мл в каждой. Первую из пробирок подвергали дезинвазии при помощи СВЧ-установки «УОМО-01/150» (время экспозиции 60 мин, мощность СВЧ-излучения 600 Вт), вторую подвергали дезинвазии путём автоклавирования (температура плюс 132 °С, экспозиция 20 мин), третью оставляли в качестве контрольной пробы. После облучения в исследуемых и контрольных образцах проводили подсчёт и оценку жизнеспособности яиц гельминтов и цист простейших.

Количество яиц и цист в экспериментальных взвесях не уравнивалось между изучаемыми возбудителями, так как в реальных условиях контаминация ими объектов окружающей среды вариабельна, а для заражения восприимчивого организма достаточно единичных инвазионных стадий. Минимальное содержания яиц и цист в экспериментальных взвесях было обусловлено яйцепродукцией половозрелых особей, степенью инвазии пациентов, от которых получен биоматериал, и количеством полученного биоматериала (фекалий). Максимальное содержание яиц и цист в экспериментальных взвесях зависело от сохранности нативных взвесей. Содержание яиц (цист) в экспериментальных взвесях соответствует обычной (случайной) контаминации предметов обихода и имеет значение только для математических расчётов в эксперименте. Количественное содержание яиц и цист в экспериментальных взвесях оценивали методом световой микроскопии нативных препаратов при увеличении ×100. Нативные препараты готовили из взвесей таким образом, чтобы паразитарные объекты располагались в один слой разрозненно и легко подвергались визуальному учёту при зигзагообразной последовательной микроскопии всей площади нативного препарата.

Методы оценки жизнеспособности были подобраны для каждого возбудителя и описаны в данной статье в соответствии с рекомендациями и терминологией МУК 4.2.2661–10 «Методы санитарно-паразитологических исследований».

Жизнеспособность яиц Enterobius vermicularis оценивали с помощью световой микроскопии (×100, ×400) неокрашенных препаратов (МУК 4.2.2661–10, п. 15.1) и люминесцентной микроскопии (×100, ×400) препаратов, окрашенных акридиновым оранжевым, в разведении 1 : 500 (МУК 4.2.2661–10, п. 15.5). При световой микроскопии у живых яиц Enterobius vermicularis наблюдались характерные морфологические особенности (размеры 50–60 × 20–30 мкм, D-образная форма, асимметричность, двухконтурная оболочка). Погибшие яйца имели видимые дефекты (сильное изменение формы, разрыв оболочки). При люминесцентной микроскопии оболочка яиц имела оранжево-красный цвет, внутреннее содержимое у жизнеспособных яиц имело тусклое серо-зелёное окрашивание, а у погибших – «горящее» светло-зелёное.

Жизнеспособность цист Entamoeba coli оценивали с помощью световой микроскопии (×100, ×400) препаратов, окрашенных акридиновым оранжевым, в разведении 1 : 500 (МУК 4.2.2661–10, п. 16.2). При световой микроскопии у цист Entamoeba coli наблюдались характерные морфологические особенности (цисты кругло-овальной и круглой формы диаметром 15–20 мкм, симметричные, с 6–8 ядрами, чёткой тонкой оболочкой, мелкозернистой цитоплазмой без деления на экто- и эндоплазму). У погибших яиц наблюдались видимые дефекты (неправильная форма, разрыв оболочки, отсутствие чётких внутренних структур при сохранении узнаваемых формы и размеров). При люминесцентной микроскопии (×400) у живых цист Entamoeba coli наблюдалось свечение оболочки оранжевым цветом, а цитоплазма не прокрашивалась. У погибших цист цитоплазма и оболочка окрашивалась в красный или красно-оранжевый цвета.

Жизнеспособность яиц Dibothriocephalus latus (Diphyllobothrium latum) оценивали с помощью световой микроскопии (×100) неокрашенных препаратов (МУК 4.2.2661–10, п. 15.1) и люминесцентной микроскопии (×100, ×400) препаратов, окрашенных акридиновым оранжевым (1 : 500) (МУК 4.2.2661–10, п. 15.5). У яиц Diphyllobothrium latum при световой микроскопии наблюдались характерные морфологические особенности (размеры 65–70 × 40–45 мкм, кругло-овальная форма, симметричность, тонкая оболочка, наличие слаборазличимой крышечки и бугорка на противоположных полюсах яйца). При люминесцентной микроскопии жизнеспособные яйца имели тусклый тёмно-зелёный или серо-зелёный цвет, а погибшие – «горящий» светло-зелёный цвет (рис. 1, см. на вклейке).

Жизнеспособность яиц Opisthorchis felineus оценивали с помощью световой микроскопии (×100, ×400) неокрашенных препаратов (МУК 4.2.2661–10, п. 15.1) и при люминесцентной микроскопии (×100, ×400). У яиц O. felineus при световой микроскопии наблюдались характерные морфологические особенности (размеры 25–27 × 15 мкм, семечковидная форма, небольшая асимметричность, тонкая оболочка, наличие крышечки на более узком полюсе и бугорка на противоположном более широком полюсе). При люминесцентной микроскопии живые яйца не люминесцировали, а погибшие имели желтовато-зелёный цвет.

Для оценки эффективности дезинвазии первоначально расчёты выполняли по формуле А.П. Симонова, рекомендованной для химических методов дезинвазии (МУК 4.2.2661–10, п. 17.2), с длительной экспозицией. Согласно данной формуле (1), в эксперименте фиксировали следующие параметры:

ОЭ_С = 100 – (a₁ · c₁/a₂ · c₂) · 100 – (P₁ – P₂) / n,           (1)

где ОЭ_С – овоцидная (протистоцидная) эффективность препарата (%); a₁ – количество живых яиц (цист) в опыте; a₂ – количество живых яиц (цист) в контроле; c₁ – количество яиц (цист), взятых для определения их жизнеспособности, в опыте; c₂ – количество яиц (цист), взятых для определения их жизнеспособности, в контроле; P₁ – процент погибших яиц (цист) в опыте; P₂ – процент живых яиц (цист) в опыте; n – количество яиц (цист) во взвеси, взятой для испытания в опыте.

Для проведения данных расчётов и оценки эксперимента рекомендовано (МУК 4.2.2661–10, п. 17.2) использовать значительные количества свежеполученных паразитарных возбудителей на стадии яиц (цист) – более 1000. Рекомендация обусловлена тем, что некоторая часть яиц (цист) станет нежизнеспособной во время длительной экспозиции в результате естественной гибели, и только оставшиеся, возможно, погибнут от воздействия изучаемых химических средств, но при этом могут сохранить свои внешние признаки [6]. Оценка жизнеспособности яиц (цист) проводится путём микроскопии с оценкой морфологических свойств и степени восприятия красителя у каждого паразитарного объекта, что достаточно трудоёмко, поэтому для определения жизнеспособности больших количеств яиц (цист) в формуле А.П. Симонова предусмотрено изучение выборки из опыта и выборки из контроля.

Предварительно проведённые экспериментальные исследования показали, что после воздействия СВЧ-излучения сохранность яиц (цист) вариабельна: некоторые сохраняют свои морфологические признаки, легко идентифицируются и подвергаются количественному учёту, другие значительно деструктурируются, распадаются на фрагменты, что затрудняет их подсчёт, остальные яйца (цисты) вовсе не обнаруживаются в опытной взвеси из-за сильного разрушения. Таким образом, после проведения эксперимента возможно корректно подсчитать только уцелевшие яйца (цисты), а не все подвергавшиеся воздействию, как это делается в экспериментах по оценке эффективности дезинвазии химическими веществ. Поэтому для эксперимента готовили взвеси свежеполученных яиц (цист) с одинаковым количеством в опытных и контрольных образцах. При таком подходе некоторые параметры формулы Симонова А.П. (n, c₁, a₂) становились заведомо равными друг другу, что позволило упростить формулу. Оценку жизнеспособности всех сохранившихся паразитарных объектов в опытных и контрольных взвесях проводили микроскопически.

Далее эффективность дезинвазии рассчитывали при помощи упрощённой методики по формуле (2) :

ОЭ_Н = 100% – (a₁ / c₂) · 100%,                     (2)

где ОЭ_Н – эффективность дезинвазии для физического фактора; a₁ – количество живых яиц (цист) в опыте; c₂ – количество яиц (цист), взятых для определения их жизнеспособности, в контроле.

Статистический анализ проводили с использованием программы StatTech v. 4.8.11 (ООО «Статтех», Россия, номер регистрации 2020615715, дата регистрации 29.05.2020 г.; включена в единый реестр российских программ для электронных вычислительных машин и баз данных (запись № 14167 от 11.07.2022 г.)).

В ходе статистического анализа количественные показатели оценивались на предмет соответствия нормальному распределению с помощью критерия Шапиро – Уилка. Количественные показатели, выборочное распределение которых соответствовало нормальному, описывались с помощью средних арифметических величин (M) и стандартных отклонений (SD). В качестве меры репрезентативности для средних значений указывались границы 95%-го доверительного интервала (95% ДИ).

Сравнение двух групп по количественному показателю, распределение которого в каждой из групп соответствовало нормальному, при условии равенства дисперсий выполнялось с помощью t-критерия Стьюдента. Различия считались статистически значимыми при p < 0,05.

Результаты

После дезинвазии проб в исследуемых и контрольных образцах проводили подсчёт и оценку жизнеспособности яиц гельминтов и цист простейших каждого возбудителя согласно вышеуказанным методикам. Полученные экспериментальные данные представлены в табл. 2 в соответствии с параметрами формулы Симонова А.П., рекомендованной в МУК 4.2.2661–10, п. 17.2.

Проведён анализ количественного значения ОЭ (%) в зависимости от метода расчёта (формулы (1), (2)). При сравнении результатов нам не удалось выявить статистически значимых различий (p = 0,919), используемый метод – t-критерий Стьюдента (табл. 3; рис. 2, см. на вклейке).

Таким образом, овоцидная (протистоцидная) эффективность в отношении изучаемых возбудителей паразитозов, рассчитанная с помощью формулы (1) Симонова А.П., сопоставима с эффективностью, рассчитанной по упрощённой формуле (2).

Согласно МУК 4.2.2661–10 (п. 17.1), овоцидная (протистоцидная) эффективность признаётся высокой при значении 90–100%; удовлетворительной – при 60–90%; неудовлетворительной – при значении менее 60%.

Согласно данным табл. 2, эффективность дезинвазии с использованием СВЧ-излучения для возбудителей с контактным механизмом передачи (Enterobius vermicularis, Entamoeba coli) составила 99–100%, а для возбудителей природно-очаговых биогельминтозов (Diphyllobothrium latum, Opisthorchis felineus) – 20–68%.

Таким образом, дезинвазию СВЧ-облучением в отношении паразитарных агентов с контактным механизмом передачи (Enterobius vermicularis, Entamoeba coli) можно считать высокоэффективной.

Для биогельминтозов Diphyllobothrium latum и Opisthorchis felineus эффективность дезинвазии проб при стандартном режиме работы СВЧ-установки, рассчитанная по двум формулам, в количественном выражении существенно различается, но интерпретирована одинаково как неудовлетворительная. Поэтому для яиц биогельминтов такая дезинвазия может рассматриваться только как дополнительная в комплексе противоэпидемических мер.

Обсуждение

В данном исследовании наибольший интерес представляла оценка дезинвазионной эффективности стандартного режима СВЧ-излучателя в отношении контактных паразитозов, а именно их инвазионных стадий (Enterobius vermicularis и Entamoeba coli). Возбудители биогельминтозов Opisthorchis felineus и Diphyllobothrium latum на стадии яйца не являются инвазионными для человека и рассматривались в рамках данного исследования дополнительно как примеры другого механизма передачи паразитарных болезней.

Дезинвазия объектов окружающей среды на современном этапе представляет собой актуальную задачу, что связано с высокой устойчивостью паразитарных агентов к агрессивным факторам, особенно это касается инвазионных для человека стадий [7]. Современные физические способы дезинвазии (механический – удаление с поверхностей во время выколачивания, встряхивания, смывания, осаждения и др.; термический – кипячение, сжигание, обжигание, фламбирование, замораживание; автоклавирование) широко применяются на практике, однако часто имеют ограничения, связанные с сохранением свойств объекта, подвергаемого дезинвазии, тогда как СВЧ-излучение относится к щадящим воздействиям, что заслуживает внимания. Согласно полученным данным, эффективность дезинвазии СВЧ-излучением оказалась сопоставима при расчётах по формуле Симонова А.П. и с помощью предложенной нами упрощённой методики.

Высокая эффективность дезинвазии СВЧ-облучением позволяет судить о перспективах его применения для бытовых и некоторых медицинских изделий многократного применения, не подлежащих кипячению, замачиванию, фламбированию (игрушки, посуда, пластиковые наконечники и др.).

Поскольку в Российской Федерации энтеробиоз является самым распространённым гельминтозом, а факторы его передачи – многочисленные предметы обихода, на поверхности которых яйца Enterobius vermicularis при комнатной температуре могут оставаться жизнеспособными неопределённо долго, появление дополнительного эффективного и доступного метода дезинвазии объектов окружающей среды открывает новые возможности в борьбе с этим гельминтозом.

Ограничения исследования. Оценка эффективности дезинвазии с применением данной методики ограничивается видами Enterobius vermicularis, Diphyllobothrium latum, Opisthorchis felineus, Entamoeba coli и требует проверки на других гельминтах и простейших.

Заключение

Альтернативные способы дезинвазии объектов окружающей среды с применением современных физических технологий имеют высокую практическую значимость для медицинских и иных учреждений, но требуют одновременной разработки соответствующих методов оценки эффективности обеззараживания. На основе оценки эффективности химического способа дезинвазии разработана упрощённая методика оценки эффективности дезинвазии с помощью кратковременного физического воздействия (на примере СВЧ-излучения). Пригодность методики для оценки дезинвазии агентов контактных паразитозов подтверждена экспериментально с использованием модельных взвесей инвазивных форм возбудителей.

Высокая эффективность СВЧ-излучения в отношении инвазионных стадий Enterobius vermicularis открывает перспективы профилактики и противоэпидемических мероприятий в отношении энтеробиоза – наиболее распространённого в Российской Федерации гельминтоза.