Сравнительное исследование накопления микропластика разного размера в яичниках крыс с использованием автоматизированного алгоритма количественной оценки

Введение

Масштабное распространение микрочастиц пластика в окружающей среде рассматривается как одна из существенных экологических и токсикологических проблем современности [1]. Микрочастицы пластика (далее – МП), образующиеся при деструкции крупных пластиковых отходов или изначально выпускаемые в виде микрогранул, обнаруживаются в воде, почве и атмосферном воздухе [1]. Попадая в пищевые цепи, МП всё чаще регистрируется в тканях и биологических жидкостях различных видов животных и человека, вызывая опасения относительно потенциальных негативных последствий для здоровья [2]. В ряде исследований показана способность полимерных частиц преодолевать барьерные структуры организма [3], что подчёркивает необходимость комплексной оценки вредного действия и распределения МП.

Различные по размеру микрочастицы могут оказывать неодинаковые биологические эффекты. Так, частицы меньшего размера обладают большей способностью к проникновению в клетки и ткани по сравнению с более крупными [4, 5]. Однако даже частицы крупнее 100 нм могут достигать определённых органов, в том числе головного мозга [6], печени, селезёнки, почек, сердца, лёгких, яичников и их придатков, матки [7]. Исследования подтверждают способность МП находиться в крови и сыворотке, накапливаться в органах и оказывать системное воздействие на организм [2]. Имеются сведения о потенциальном репротоксическом действии. Так, введение беременным мышам МП размером 900 нм снижало массу тела плода [8]. Также МП способны провоцировать апоптоз клеток у плода путём индукции окислительного стресса, что было показано в исследовании, нацеленном на изучение головного мозга мышей [9]. При этом не накоплено достаточных научных знаний о том, как в яичники проникают МП различных размеров.

Яичники являются одним из ключевых органов женской репродуктивной системы, обеспечивая формирование и созревание ооцитов, а также синтез половых гормонов. Нарушения этих процессов в результате действия ксенобиотиков способны приводить к снижению плодовитости и патологиям беременности, что было показано в исследованиях на беременных мышах [8, 9]. Возможно, более мелкие микрочастицы (например, диаметром около 100 нм) могут легче преодолевать капсулу яичника и проникать в фолликулы, тогда как более крупные (до 1000 нм) могут откладываться в сосудистом русле или в межклеточных пространствах, образуя агрегаты. Несмотря на предварительно полученные данные [10, 11], эти гипотезы требуют количественного подтверждения в экспериментальных моделях, отвечающих требованиям репрезентативности и воспроизводимости результатов. Предположительно, МП различного размера будут по-разному распределяться в тканях яичника.

С учётом описанных выше проблем, их научной значимости цель настоящего исследования – определить и сопоставить особенности накопления МП различного размера (100; 500 и 1000 нм) в яичниках крыс при остром системном введении с использованием специально разработанной программы для автоматизированной количественной оценки флуоресцентных изображений.

Материалы и методы

Для достижения целей экспериментального исследования в качестве модельных организмов использовали половозрелых самок крыс линии Wistar (n = 12) массой тела 180–200 г, полученных из специализированного питомника «Рапполово». Животные содержались в виварии, оборудованном в соответствии с требованиями ГОСТ 33215–2014, регулирующего содержание лабораторных животных. Все манипуляции выполнялись с соблюдением международных стандартов, установленных Директивой Европейского парламента и Совета Европейского союза 2010/63/ЕС от 22.09.2010 г. Протокол эксперимента был одобрен локальным этическим комитетом (решение № 01–02 от 08.02.2024 г.). Животные были разделены на 4 группы по 3 особи в каждой. Введение суспензии МП осуществлялось внутрисердечно в объёме 0,5 мл с использованием физиологического раствора в качестве контрольного вещества. Внутрисердечное введение, хотя и не является естественным путём предположительного поступления МП в организм, было выбрано нами в этом исследовании, поскольку такой метод позволил точно контролировать дозировку и оценить распределение МП в организме без риска задержки подавляющей доли микрочастиц в кишечнике животных. Имеются данные, согласно которым 10% проглатываемых наночастиц пластика размером 60 нм оседают в кишечнике крыс [12]. В этом контексте стоит отметить, что микрочастицы, имеющие ещё больший размер, обладают менее эффективной кинетикой [13]. МП с максимальным размером более 150 мкм не проникают в системный кровоток [14]. В исследовании Carr K.E. и соавт. (2012) только 0,3% перорально введённых латексных частиц с наибольшим размером 2 мкм проникали через кишечный эпителий [15]. Таким образом, выбор внутрисердечного введения был обусловлен необходимостью минимизировать влияние абсорбции микрочастиц при пероральном введении.

В исследовании применяли флуоресцентно меченные полистирольные микрочастицы (QiuHuan, КНР) диаметром 100; 500 и 1000 нм в виде 1%-й водной суспензии. Частицы характеризовались следующими спектральными параметрами: максимум возбуждения – 488 нм, максимум эмиссии – 518 нм. Перед введением суспензия подвергалась диспергированию в ультразвуковой ванне УЗО «МЕДЭЛ» с последующим перемешиванием на ротаторе BioSan. Контроль качества суспензии проводился с использованием флуоресцентного микроскопа Celena X (Logos Biosystems, Южная Корея) с фильтром EGFP.

Через 5 ч после введения суспензии животных подвергали эвтаназии углекислым газом с последующей декапитацией. Отбор образцов яичников проводился немедленно после забоя. Полученные образцы хранились при температуре минус 70 °C до момента анализа. Приготовление гистологических срезов толщиной 10 мкм осуществляли на криостате Leica СМ 1520 (Leica BioSystems, Германия). Проводили фотографирование при увеличении ×200 со светофильтром EGFP в имиджере Celena X (Logos Biosystems, Южная Корея) и описательную оценку микропрепаратов. Поскольку каждая экспериментальная группа состояла из трёх животных, для повышения надёжности полученных данных мы собрали по четыре образца в разных участках органа от каждого животного, что в сумме дало 12 образцов для анализа. Поскольку фокус работы был сосредоточен на общем накоплении частиц, а не его особенностях в зависимости от фазы полового цикла, последние у самок крыс не контролировались в данном исследовании.

Количественная оценка МП и их конгломератов в биологических образцах осуществлялась с применением специально разработанной программы Microplastic detector (патент Российской Федерации на программу для ЭВМ, № 2024685872 от 02.11.2024 г.). Программное обеспечение было разработано на языке Python 3.10 с использованием библиотек OpenCV (для обработки изображений) и NumPy (для численных вычислений). Алгоритм работы программы включает несколько этапов. Сначала осуществляется выбор входного каталога с изображениями и выходного каталога для сохранения результатов. Оператор вводит параметры частиц (форма и размер). В случае экспериментальной оценки параметры задавались на основе данных о введённых частицах. Микрофотографии, по четыре изображения от каждого животного, преобразовывались в градации серого для дальнейшего анализа в соответствии с заданными параметрами. Затем применяется пороговая обработка для выделения отдельных МП. Накопленная маска создаётся путём применения пороговых значений в заданном диапазоне, который указывается оператором. На следующем этапе реализуются поиск контуров на маске изображения, анализ их площади и округлости, а также фиксация и окрашивание контуров, соответствующих заданным параметрам. Анализ площади и контуров выполняются с помощью независимых функций. Для классификации частиц по форме используется метрика округлости, которая была введена для улучшения поиска микрочастиц сферической формы. Частицы считаются округлыми, если значение метрики превышает заданный оператором порог, который вводится вручную в зависимости от характеристик искомого объекта. Далее создаётся маска областей без отдельных частиц, выполняются пороговая обработка для выделения конгломератов и анализ их контуров. Конгломераты выделяются на основе маски, исключающей индивидуальные частицы. На финальном этапе происходит сохранение обработанных изображений и результатов анализа (количество частиц, площадь, плотность) в виде таблицы Microsoft Excel.

Анализ полученных в экспериментальном исследовании данных проводился с применением метода Bootstrap с поправкой Холма – Бонферрони. Данный подход позволил снизить влияние ограниченного размера выборки, обеспечивая при этом строгие критерии статистической значимости [16]. Уровень статистической значимости установлен как p < 0,05. Все вычисления выполнялись с использованием языка программирования Python 3.10.

Результаты

На рис. 1 (см. на вклейке) представлены микрофотографии фрагментов тканей яичников животных контрольной группы и животных, подвергшихся воздействию МП, полученные во флуоресцентном режиме. В контрольной группе наблюдается фоновое свечение тканей, срез демонстрирует чёткое структурное разделение. Мозговое вещество представлено рыхлой соединительной тканью с выраженной васкуляризацией (светящиеся точечные структуры) и ветвящимися эпителиальными канальцами сети яичника (см. рис. 1.1). В группе МП 100 визуализируются многочисленные флуоресцирующие скопления, преимущественно локализованные вокруг третичных фолликулов (см. рис. 1.2). В группе МП 500 также отмечаются множественные флуоресцирующие элементы, представленные как изолированными частицами, так и их конгломератами, сосредоточенными преимущественно в околофолликулярной зоне (см. рис. 1.3). В группе МП 1000 преобладают крупные конгломераты, локализованные вокруг жёлтого тела, однако визуализируются и отдельные частицы (см. рис. 1.4).

На рис. 2 (см. на вклейке) представлены микрофотографии фрагментов тканей яичников крыс контрольной группы и групп, подвергшихся воздействию МП, полученные во флуоресцентном режиме при большем увеличении. На срезах контрольной группы (2.1–2.3) визуализируется преимущественно мозговое вещество без признаков накопления микрочастиц: отсутствуют светящиеся округлые объекты с чёткими контурами, а также их конгломераты. В группе МП 100 (2.4–2.6) наблюдаются флуоресцирующие объекты округлой формы, их скопления и отдельные конгломераты в области мозгового вещества. В срезах групп МП 500 (2.7–2.9) и МП 1000 (2.10–2.12) выявляются как одиночные микрочастицы, так и их конгломераты, локализованные преимущественно в корковом и мозговом слоях; на изображениях 2.9 и 2.12 визуализируются края фолликулов с локальными скоплениями микрочастиц вокруг них.

На рис. 3 представлены результаты количественной оценки степени накопления и распределения МП и его конгломератов в тканях яичников. Согласно данным анализа, выполненного с использованием специально разработанной программы, в контрольной группе были зарегистрированы единичные сигналы (0,42 ± 0,25 ед.), обусловленные, вероятно, фоновым свечением и находящиеся в пределах допустимой погрешности, поскольку на этих животных не воздействовали частицы МП. В экспериментальных группах количество флуоресцирующих объектов было существенно выше: 316,92 ± 44,03 ед. в группе МП 100, 208,00 ± 73,08 ед. в группе МП 500 и 979,17 ± 238,54 ед. в группе МП 1000. Полученные значения отличались от контрольных (р = 0,001 для групп МП 100 и МП 1000; р = 0,014 для группы МП 500). Также установлены значимые различия между группами МП 100 и МП 500 (р = 0,013), а также между группами МП 500 и МП 1000 (р = 0,007). Оценка площади МП в тканях осуществлялась в пикселях и выявила аналогичную динамику: в контрольной группе показатель составил 1,42 ± 1,11 пикс., тогда как в экспериментальных группах площадь достоверно увеличивалась: до 9661,75 ± 1647,35 (МП 100), 5875,92 ± 1924,55 (МП 500) и 15934,33 ± 3488,31 пикс. (МП 1000) соответственно. Во всех случаях различия с контролем были статистически значимыми (р = 0,01). Также зафиксированы достоверные различия между группами МП 500 и МП 1000 (р = 0,012).

При анализе количества конгломератов МП установлено, что в контрольной группе количество предполагаемых конгломератов составило 25,08 ± 10,81 ед., что может быть связано с ошибочной интерпретацией фонового свечения. В то же время в опытных группах значения были существенно выше: 406,67 ± 153,18 ед. (МП 100), 65 ± 21,87 ед. (МП 500) и 98,17 ± 30,83 ед. (МП 1000). Однако из-за высокой дисперсии межгрупповые различия не достигли уровня статистической значимости. Оценка площади конгломератов выявила, что в группе МП 1000 (8400,58 ± 2611,56 пикс.) и МП 100 (2803,58 ± 595,51 пикс.) площадь была достоверно выше, чем в контроле (363,08 ± 154,13 пикс.; площадь может быть также связана с ошибочной интерпретацией фонового свечения) при р = 0,010 и р = 0,001 соответственно. В группе МП 500 площадь также была увеличена (3212,88 ± 1449,49 пикс.), однако различия по сравнению с контролем не достигли статистической значимости (р = 0,147), между экспериментальными группами достоверных различий также не выявлено.

Обсуждение

Яичники обладают специфической архитектурой, сочетающей в себе функционально активную корковую зону, где располагаются фолликулы, и мозговое вещество с богато васкуляризированной соединительной тканью. Высокая васкуляризация и интенсивный гормональный обмен делают яичники потенциально уязвимыми к накоплению и воздействию ксенобиотиков, в том числе МП [17]. Любые изменения в структуре или функции этого органа могут неблагоприятно сказаться на репродуктивной функции, гормональном статусе организма, также, вероятно, на качестве созревающих фолликулов. Поэтому изучение проникновения МП в различные зоны яичника, возможности формирования внутриорганных конгломератов, установление межразмерных отличий крайне важны при оценке потенциальных рисков репродуктивной токсичности. Известно, что прямой контакт клеток живой системы с МП может вызвать неблагоприятные последствия на клеточном уровне [18].

Полученные результаты подтвердили способность флуоресцентно меченных МП размером 100; 500 и 1000 нм проникать в структуру яичников в течение короткого промежутка времени (5 ч) после острого системного введения (см. рис. 1, 2 на вклейке).

При сравнительном анализе наибольшее абсолютное число зарегистрированных флуоресцирующих объектов выявлено нами в группе МП 1000, что может быть частично обусловлено лучшей видимостью и более интенсивной флуоресценцией крупных частиц. Вместе с тем выявленная у частиц диаметром 100 нм тенденция к образованию обширных конгломератов указывает на возможную склонность меньших по размеру элементов к агрегации внутри тканей. Похожий эффект агрегации более мелких частиц был описан в ряде экспериментальных работ. Так, в экспериментальном исследовании с полистирольными микрочастицами (1; 3 и 6 мкм) в пресной воде установлено, что 84% частиц размером 1 мкм образуют агрегаты за 72 ч, тогда как для частиц размером 6 мкм этот показатель составляет всего 33% [19]. В другом исследовании, также посвящённом поведению МП в условиях внешней среды, показано, что критическая концентрация коагуляции увеличивается с ростом размера частиц, что указывает на снижение стабильности мелких частиц [20]. Несмотря на отсутствие работ, напрямую сравнивающих склонность к агрегации МП различного размера in vivo, известно, что в биологических средах частицы нано- и микрометровых диапазонов демонстрируют выраженную размер-зависимую агрегационную устойчивость: с уменьшением размера частицы становятся менее стабильными и более склонными к слипанию [21, 22]. В рамках настоящего исследования мы предполагаем, что аналогичный механизм может быть характерен и для МП, однако данная гипотеза требует дальнейшего экспериментального подтверждения. Различия в суммарной площади одиночных МП также ожидаемо зависят от их диаметра: в группе МП 1000 наблюдали самый высокий показатель площади одиночных частиц, однако суммарная площадь их конгломератов была ниже, чем в группе МП 100. Возможно, более крупные микрочастицы ввиду своих размеров и, вероятно, отличий в поверхностном заряде не склонны к слипанию в крупные агломераты, а преимущественно остаются изолированными включениями в тканях.

Важно учитывать, что в настоящем исследовании не производилась дополнительная иммунофлуоресцентная верификация локализации сосудистого русла. Следовательно, не исключено, что часть визуализируемых сигналов могла находиться в просветах сосудов, особенно с учётом интенсивной васкуляризации мозгового вещества яичников (см. рис. 1, 2, на вклейке). Для более точного разграничения флуоресценции в ткани и сосудистом русле в дальнейшем необходимо задействовать маркёры эндотелиальных клеток или проводить последовательные срезы, окрашенные для выявления кровеносных сосудов. Следует отметить и такой фактор, как фаза полового цикла, потенциально влияющий на проницаемость тканевых барьеров и метаболизм ксенобиотиков. В настоящей серии экспериментов мы не контролировали фазу цикла, что могло стать причиной некоторой вариабельности результатов. Однако статистически значимые различия между группами подтверждают, что сам эффект накопления МП явно перевешивает влияние колебаний гормонального фона, по крайней мере в рамках острого воздействия. Тем не менее для углублённого анализа влияния МП на репродуктивную функцию важно в дальнейшем включать в дизайн эксперимента контроль фаз цикла, учитывать данные о потенциальной изменчивости сосудистой проницаемости в разные периоды.

Отличительной особенностью настоящей работы стало применение специализированной программы Microplastic detector, позволяющей в автоматическом режиме проводить морфометрический анализ и распознавание МП на флуоресцентных микрофотографиях. Благодаря последовательному учёту морфологических критериев (округлость, размер) и многоступенчатому порогированию программа минимизирует субъективную ошибку оператора, обеспечивая воспроизводимость данных даже при работе с небольшим числом образцов. В отличие от универсальных инструментов, где для сходных операций оператору пришлось бы вручную осуществлять порогирование или настраивать макросы, Microplastic detector автоматически генерирует и объединяет результаты по заданному диапазону пороговых значений. Отдельные настройки для конгломератов позволяют учитывать специфику каждого набора изображений. Кроме того, программа не только формирует сводные таблицы для последующего статистического анализа, но и сохраняет визуально размеченные изображения, обеспечивая прозрачность и верифицируемость на всех этапах обработки. Преимущество программы – унифицированный протокол анализа, который подразумевает однократную настройку параметров, после чего все изображения обрабатываются одинаково, что особенно ценно при больших массивах данных. В перспективе расширение функционала (в том числе применение методов машинного обучения и нейронных сетей) позволит повысить точность классификации частиц и выявлять более сложные паттерны их распределения в тканях.

Таким образом, полученные нами данные подтверждают, что даже короткое по времени воздействие способно приводить к накоплению МП в тканях яичников, а характер локализации и формирования конгломератов зависит от размера частиц. Наблюдаемые различия в агрегировании крупных и мелких частиц свидетельствуют о сложном взаимодействии физических и биологических факторов, определяющем конечную картину распределения МП в органе. Тем не менее, несмотря на расширение данных о взаимодействии МП с живым организмом, полноценная оценка влияния этих частиц на репродуктивное здоровье требует дальнейших исследований с акцентом на гормональную регуляцию, процессы овуляции, имплантации и возможные генотоксические эффекты. Углублённый анализ позволит сформировать более полное представление о рисках репродуктивной токсичности МП и разработать эффективные методы профилактики его возможных негативных последствий.

Заключение

Показано, что микрочастицы пластика размером 100; 500 и 1000 нм при внутрисердечном введении в объёме 0,5 мл аутбредным самкам крыс обнаруживаются в яичниках. Таким образом, несмотря на значительные достижения в понимании механизмов проникновения и накопления микрочастиц пластика, особенности их влияния на репродуктивную систему остаются недостаточно изученными.

Одним из ограничений нашего исследования является отсутствие учёта фазы полового цикла у самок крыс, что могло повлиять на индивидуальные различия в накоплении микрочастиц пластика в яичниках. Гормональные колебания в разные фазы цикла могли изменять проницаемость тканей и накопление микрочастиц, поэтому будущие исследования должны учитывать гормональный статус животных для более точной интерпретации данных.