Биотестирование глубоких эвтектических растворителей с использованием фитотеста и аллиум-теста (Аllium test)

Введение

Глубокие эвтектические растворители (ГЭР), представляющие собой смеси соединений, образующие легкоплавкую смесь при комнатной температуре, в последнее десятилетие стали привлекать внимание исследователей благодаря уникальным физико-химическим свойствам и потенциальному применению в различных областях науки и техники [1]. Зачастую указывается, что эти смеси характеризуются низкой токсичностью, биоразлагаемостью и экологической совместимостью, что делает их перспективными заменителями традиционных органических растворителей [2].

В контексте исследования токсикологических характеристик ГЭР можно отметить, что, несмотря на присутствие в их составе природных компонентов, отдельные составляющие могут проявлять выраженную токсичность по отношению к биологическим объектам. Примечательно, что даже в случаях, когда исходные компоненты ГЭР характеризуются отсутствием токсического потенциала, формирующаяся эвтектическая система может проявлять качественно новые свойства. Исследования свидетельствуют о невозможности адекватной оценки токсикологического профиля ГЭР путём простого суммирования характеристик входящих в его состав компонентов [3]. Дополнительно установлено, что количественные показатели токсичности ГЭР находятся в функциональной зависимости от реологических характеристик, в частности от вязкости системы [4]. Данные наблюдения свидетельствуют о формировании ГЭР как качественно нового типа псевдохимических соединений со специфическими физико-химическими и токсикологическими свойствами, отличающими их от исходных компонентов, требующих пристального изучения.

Одним из ключевых аспектов исследования безопасности соединений является оценка токсичности с помощью биотестирования – способности веществ оказывать влияние на рост и развитие тест-организмов. Некоторые исследования безопасности составов ГЭР и актуальность их биотестирования подтверждают данные работ [5, 6].

Для оценки токсичности используются различные протоколы, среди которых чувствительными и простыми являются методы на основе высших растений – фитотестирование и аллиум-тест [7]. Фитотестирование основано на измерении длины корней проростков растений, выращенных в присутствии исследуемого вещества. Ферментативные реакции влияют на прорастание семени, происходит активизация процессов внутри клетки, а различные ксенобиотики могут подавлять рост и развитие растения [8]. Этот метод позволяет быстро оценить воздействие химического соединения на растительные организмы [9]. Аллиум-тест используется для определения мутагенного потенциала веществ путём анализа хромосомных аномалий в меристематических клетках корня лука и вычисления показателя митотического индекса деления клеток (МИ) [10].

В литературе представлены исследования, посвящённые изучению токсичности ГЭР с применением тест-систем in vivo [11] (фитотестирование и др.), например, на семенах пшеницы Triticum aestivum (L.) [12–14], кресс-салата Lepidium sativum (L.) [15], лука посевного Lactuca sativa (L.) [16], а также с совмещением фитотестирования и цитотоксических методов на основе анализа хромосомных аберраций в клетках меристемы корня чеснока Allium sativum (L.) [17].

Ранее была определена антимикробная активность используемых в работе составов ГЭР и экстрактов из листьев Chamaeneríon angustifolium (L.) Scop на их основе в отношении бактериальных культур Bacillus pumilus, Microbacterium paraoxydants и Acinetobacter lwoffii, а также цитотоксичность ГЭР и растительных экстрактов в отношении клеток линии карциномы шейки матки HeLa и почек эмбриона человека HEK293 с использованием МТТ-теста. Было показано, что все экстракты С. angustifolium на основе ГЭР в высоких концентрациях (10, 1 об.%) обладали антимикробной активностью в отношении тестируемых бактериальных штаммов. При этом наибольшую токсичность для всех бактериальных культур проявил экстракт на основе лимонной кислоты, глицерина и воды в соотношении 1 : 4 : 20. Цитотоксический эффект был меньше выражен для линии клеток почек эмбриона человека после обработки составом ГЭР «хлорид холина + лимонная кислота + вода» в соотношении 1 : 2 : 43, для раковых клеток – «хлорид холина + глицерин + вода» в соотношении 1 : 2 : 11 [18]. Однако указанные в настоящем исследовании составы не тестировались на моделях in vivo.

Цель исследования – оценка токсичности глубоких эвтектических растворителей «хлорид холина + глицерин + вода», «хлорид холина + лимонная кислота + вода» и «лимонная кислота + глицерин + вода» с использованием фитотеста и аллиум-теста.

Материалы и методы

Для эксперимента использовали: хлорид холина (99%, Rongsheng Biotech, Китай), глицерин, лимонную кислоту (> 99%, Вектон, Россия), деионизированную воду (Simplicity UV, Германия).

Для приготовления микропрепаратов использовали фиксатор Кларка (96 об.% этиловый спирт + 45 об.% ледяная уксусная кислота в пропорциях 3 : 1), краситель ацетоорсеин 1%-й (орсеин, ООО «ПанЭко», Россия), спирт этиловый 96 об.% (ООО «РосБио», Россия), ледяную уксусную кислоту 99,8% (ГК «Русхим, Россия), 1%-ю перекись водорода (ООО «Тульская фармацевтическая фабрика», Россия).

В качестве тест-культур использовали: лук репчатый Allium cepa (L.) сорт «Штуттгартер ризен» («Ростлайн Агросервис», Россия), семена горчицы белой Sinapis alba (L.) (производитель ООО «Агрофирма Балтийская», Россия), семена овса голозёрного Avena nuda (L.) (ООО «Аратай», Россия).

Для биотестирования использовали ГЭР «хлорид холина (ChCl) + глицерин (Gly) + вода (H₂O)» в молярном соотношении 1 : 2 : 11, «хлорид холина (ChCl) + лимонная кислота (Cit) + вода (H₂O)» в молярном соотношении 1 : 2 : 43, «лимонная кислота (Cit) + глицерин (Gly) + вода (H₂O)» в молярном соотношении 1 : 4 : 20. Поскольку эти растворители представляют собой водородно-связанные комплексы, то здесь и далее их составы будут записываться как формулы комплексных соединений [ChCl][Gly]₂[H₂O]₁₁, [ChCl][Cit]₂[H₂O]₄₃ и [Cit][Gly]₄[H₂O]₂₀ соответственно. Приготовление и изучение физико-химических характеристик данных составов подробно описано в работах [19, 20].

Фитотестирование. Фитотестирование проводили на семенах горчицы белой с измерением длины корней, расчётом фитоэффекта торможения (ФЭТ, %) и полуэффективной концентрации (ЭК₅₀, %). На основании расчётов ФЭТ пробы разделяли по токсичности: нетоксичные (ФЭТ ≤ 20%), слаботоксичные (20 < ФЭТ < 50%) и токсичные (ФЭТ > 50%) [21]. Овёс голозёрный был использован аналогично в качестве тест-культуры.

Для фитотестирования использовали сходные по размеру семена горчицы белой и овса голозёрного. Перед проведением эксперимента семена промывали проточной водой и проводили проверку всхожести семян [21]. Приготовленные составы ГЭР доводили до объёмных концентраций 10; 1 и 0,1% деионизированной водой. В качестве контроля использовали дистиллированную воду. 10 мл раствора вносили на уложенную в планшеты для фитотестирования (ООО «Европолитест», Москва) фильтровальную бумагу и укладывали на неё семена в ряд на расстоянии 1 см друг от друга и от края планшета. На каждую пробу и контроль использовали по 15 семян, экспонировали 72 ч при температуре плюс 22 °С, освещённости 12 ч и влажности 40%. Первые сутки планшеты находились в горизонтальном положении во избежание ссыпания семян на дно планшета. Эксперимент проводили в шестикратных повторностях (три планшета на одно среднее значение ФЭТ). Измерения длины корней проводили с помощью линейки ГОСТ 427–75 от нижней точки стебля до конца корня (в миллиметрах).

Аллиум-тест. Процедуру тестирования проводили по методике с предварительной проверкой на жизнеспособность луковиц по Фискесджо [22]. После проверки выбрали по три луковицы на каждый состав ГЭР и концентрации, контроли; экспонировали 96 ч в темноте при температуре плюс 22 °С. В качестве отрицательного контроля была взята дистиллированная вода, в качестве положительного – 1%-я перекись водорода [23]. Корни помещали в фиксатор Кларка на 24 ч, затем промывали 80%-м этиловым спиртом с последующим хранением в нём же.

Для микроскопии корни промывали от этилового спирта в дистиллированной воде и окрашивали по методике Медведевой М.Ю. с соавт. [24]. Для каждой пробы брали по 5 корней и подсчитывали около 1000 клеток в зоне роста корня на увеличении ×400. Отмечали фазы митоза и хромосомные аберрации с помощью фотосъёмки. Данные обрабатывали с помощью программы «Allium cepa Tool» автоматического подсчёта клеток на основе искусственного интеллекта и языка программирования Python [25]. МИ рассчитывали как отношение количества всех делящихся клеток к общему количеству подсчитанных клеток в препарате, выраженное в процентах. Также рассчитывали процент хромосомных аберраций.

Статистическая обработка. Для вычисления средних показателей, расчёта ФЭТ и среднего квадратичного отклонения повторяемости при фитотестировании использовали MS Excel по методике [21].

Статистический анализ данных аллиум-теста (критерий Шапиро – Уилка, однофакторный дисперсионный анализ и критерий Тьюки) и проводили в программе R-studio 4.0.4 (R Core Team, 2021). Уровень значимости был принят при p < 0,05.

Результаты

Фитотестирование. Результаты представлены на рис. 1. Было отмечено, что в концентрациях 10% все растворы ГЭР показали токсичность, прорастания семян горчицы не происходило.

Составы [ChCl][Cit]₂[H₂O]₄₃ и [Cit][Gly]₄[H₂O]₂₀ в концентрации 1% также были токсичны (ФЭТ = 89% и ФЭТ = 84% соответственно).

Состав [Cit][Gly]₄[H₂O]₂₀ в концентрации 0,1% показал умеренную токсичность (ФЭТ = 50%).

ГЭР [ChCl][Gly]₂[H₂O]₁₁ в концентрациях 1 и 0,1% показали слабую токсичность (ФЭТ = 38% и ФЭТ = 34% соответственно).

ГЭР [ChCl][Cit]₂[H₂O]₄₃ в концентрации 0,1% также показал слабую токсичность (ФЭТ = 34%) (см. рис. 1).

Фитотестирование на семенах овса показало, что в 10% концентрациях все растворы токсичны, прорастания семян также не происходило.

Растворы [ChCl][Cit]₂[H₂O]₄₃ в концентрации 0,1%, [Cit][Gly]₄[H₂O]₂₀ в концентрации 0,1%, [ChCl][Gly]₂[H₂O]₁₁ в концентрациях 1 и 0,1% имели слабую токсичность (ФЭТ = 43%, ФЭТ = 26%, ФЭТ = 33% и ФЭТ = 35% соответственно).

Растворы [ChCl][Cit]₂[H₂O]₄₃, [Cit][Gly]₄[H₂O]₂₀ в концентрации 1% имели высокую токсичность (ФЭТ = 74% и ФЭТ = 84% соответственно) (см. рис. 1).

После вычисления значения ФЭТ был сделан расчёт ЭК₅₀ для каждого объекта фитотеста. У семян горчицы белой ЭК₅₀ составил для [ChCl][Gly]₂[H₂O]₁₁ 1,44%, для [ChCl][Cit]₂[H₂O]₄₃ 0,16% и для [Cit][Gly]₄[H₂O]₂₀ 0,09%. Те же расчёты у овса голозёрного показали значения ЭК₅₀ [ChCl][Gly]₂[H₂O]₁₁ 1,99%, для [ChCl][Cit]₂[H₂O]₄₃ 0,24% и для [Cit][Gly]₄[H₂O]₂₀ 0,25%.

Аллиум-тест. После воздействия составов ГЭР отмечен рост корней в [ChCl][Cit]₂[H₂O]₄₃ в концентрации 0,1%, [ChCl][Gly]₂[H₂O]₁₁ в концентрациях 1 и 0,1%. В пробах [ChCl][Gly]₂[H₂O]₁₁ 10%, [ChCl][Cit]₂[H₂O]₄₃ 10 и 1%, [Cit][Gly]₄[H₂O]₂₀ 10; 1 и 0,1% отмечена гибель корней.

В результате вычисления показателя митотического индекса (МИ) обнаружены статистически значимые отличия значений опытных растворов по сравнению с положительным и отрицательным контролями ([ChCl][Gly]₂[H₂O]₁₁, 1%, и [ChCl][Gly]₂[H₂O]₁₁, 0,1%) и отрицательным контролем ([ChCl][Cit]₂[H₂O]₄₃, 0,1%). Растворы оказывали митодепрессивное действие по сравнению с отрицательным контролем.

По количеству хромосомных аберраций статистически значимые различия по сравнению с отрицательным контролем показали все растворы. Интересно, что [ChCl][Gly]₂[H₂O]₁₁ в концентрации 0,1% вызывал большее количество хромосомных нарушений, чем [ChCl][Gly]₂[H₂O]₁₁, 1% (см. таблицу).

Часто встречаемой хромосомной аберрацией было слипание хромосом, единично встречались мосты, нарушения работы веретена деления клетки, С-митоз (рис. 2).

Обсуждение

При биотестировании ГЭР следует учитывать следующий нюанс: в данном случае тестирование именно неразбавленных ГЭР не представляется возможным ввиду либо высокой вязкости, либо низкого значения рН этих растворителей. ГЭР необходимо разбавлять водой также для снижения плотности и вязкости, что облегчает работу с этими смесями. Однако сильное разбавление может разрушить структуру водородных связей. В то же время воздействие чистых ГЭР на окружающую среду маловероятно. Используемые в настоящей работе разбавления ГЭР находятся в области, где происходит разрушение водородных связей между компонентами [26]. Таким образом, следует говорить о комбинированном воздействии раствора компонентов ГЭР на те или иные тест-организмы.

Фитотестирование показало, что в целом результаты соотносятся с данными о биоразлагаемости и слабой токсичности состава на основе [ChCl][Gly]₂[H₂O]₁₁ [12]. Аллиум-тест показал, что используемые составы [ChCl][Cit]₂[H₂O]₄₃ и [Cit][Gly]₄[H₂O]₂₀ токсичны для корней, вероятно, из-за изменения pH, разбавления составов водой и синергетических эффектов [5]. Вызываемые составом [ChCl][Gly]₂[H₂O]₁₁ хромосомные аберрации в меристематических клетках корня A. cepa описаны в целом для тест-модели A. sativum после обработки различными составами ГЭР [17].

На основании полученных результатов можно заключить, что компоненты выбранных ГЭР влияют на тестовые объекты, оказывая в разной степени токсическое действие в зависимости от входящих в состав веществ, концентрации раствора и индивидуальных особенностей тест-организмов. Отметим, что индивидуальная реакция живого организма может стать ограничивающим фактором исследования.

Таким образом, проведённое исследование подчёркивает актуальность оценки токсичности составов ГЭР разными методами и в разных условиях тестирования на живых моделях in vitro и in vivo из-за сложности протекания многих процессов в организме тест-модели, различных изменений в химической структуре составов ГЭР после разбавления водой и совокупности последующих эффектов. Немаловажны также исходные составляющие ГЭР.

Заключение

В настоящей работе была исследована токсичность растворов ГЭР [ChCl][Gly]₂[H₂O]₁₁, [ChCl][Cit]₂[H₂O]₄₃ и [Cit][Gly]₄[H₂O]₂₀ в концентрациях 10;, 1 и 0,1% с использованием фитотестирования на горчице белой S. alba (L.), овсе голозёрном A. nuda (L.) и аллиум-теста на луке репчатом A. cepa (L.). Было показано, что составы в концентрации 10% проявляли острую токсичность в отношении всех тестовых организмов.

Состав [ChCl][Gly]₂[H₂O]₁₁ в концентрации 1 и 0,1% показал слабую токсичность на выбранных тест-объектах. Примечательно, что концентрация этого состава 0,1% вызывала несколько большее влияние на лук репчатый и овёс, чем концентрация 1%, показывая сходство отклика тестовых организмов. [ChCl][Gly]₂[H₂O]₁₁ в целом показал либо слабую, либо умеренную токсичность в отличие от остальных растворов, что согласуется с некоторыми литературными данными и ранее полученными результатами. [ChCl][Cit]₂[H₂O]₄₃ в концентрации 1% показал токсичность в отношении всех тест-организмов, а в концентрации 0,1% показал слабую токсичность для горчицы белой и овса, но оказался токсичен для лука репчатого. [Cit][Gly]₄[H₂O]₂₀ в концентрации 0,1% показал умеренную и слабую фитотоксичность для горчицы белой и овса голозёрного, острую – для лука репчатого. Концентрация 1% оказывала токсическое действие на все исследуемые организмы.

Обобщая полученные результаты, можно констатировать, что выбранные тест-организмы показали разную степень чувствительности, что говорит об их индивидуальных реакциях. Следовательно, важна оценка токсичности ГЭР разными методами и в разных условиях составов ГЭР из-за сложных взаимодействий веществ в самом составе и изменения его химической структуры после разбавления водой.

Представленные в настоящей работе данные позволяют составить токсикологический профиль исследуемых составов ГЭР, что необходимо для понимания процессов их биодеградации и действия на тестовые системы для применения в биотехнологических процессах.