Экспозиция редкоземельными элементами и однонуклеотидные замены как факторы риска, формирующие раннее сосудистое старение у работников титано-магниевого производства

Введение

Широкое использование в высокотехнологичных отраслях промышленности редкоземельных элементов (РЗЭ) обусловливает постоянный рост их производства и, как следствие, увеличение числа работников, подвергающихся профессиональной экспозиции [1, 2]. Несмотря на растущую распространённость, оценка рисков для здоровья, связанных с воздействием РЗЭ, остаётся недостаточно изученной [3]. Особую актуальность эта проблема приобретает на предприятиях цветной металлургии, в частности титано-магниевого профиля, где работники могут подвергаться сочетанному воздействию аэрозолей, солей и оксидов титана и РЗЭ при восстановлении, дистилляции и легировании титана и редких металлов [4]. Лантаноиды, проникая в организм ингаляционным путём, обладают способностью к кумуляции в органах и тканях [5]. Биологическое действие РЗЭ связывают с их способностью индуцировать окислительный стресс, нарушать функцию митохондрий и инициировать процессы апоптоза и сосудистого старения [3]. Исследования на животных моделях и ограниченные эпидемиологические данные указывают на то, что РЗЭ могут модулировать иммунный ответ, вызывая как супрессию, так и гиперактивацию отдельных его звеньев, запуск иммунных механизмов атерогенеза [6]. Современные исследования в области медицины труда основываются на применении методов молекулярно-генетического анализа, обеспечивающих разработку высокоинформативных маркёров оценки риска развития профессионально обусловленных патологий [7]. Полиморфизмы генов, кодирующих ключевые белки обменных и регуляторных процессов (например, гены ангиотензиногена AGT rs429358 и аполипопротеина ApoE rs429358), могут существенно влиять на восприимчивость организма к действию вредных факторов, в том числе посредством модификации иммунного профиля [8]. Токсикологические и иммунологические исследования последствий воздействия РЗЭ на здоровье до последнего времени были относительно редкими, и многие вопросы остаются открытыми, в первую очередь это касается неблагоприятных последствий производственной экспозиции РЗЭ [9].

Цель исследования – оценка иммуногенетических особенностей сосудистого старения у работников (на примере титано-магниевого производства) в условиях экспозиции редкоземельными элементами (РЗЭ) для ранней диагностики и профилактики производственно обусловленных болезней.

Материалы и методы

Проведено комплексное иммунологическое и генетическое обследование работников титано-магниевого комбината, в которое были включены 117 работников (71 женщина и 46 мужчин). Основную группу составили 53 работника (21 женщина и 32 мужчины) в возрасте 54,42 ± 1,55 года, занятые в технологических процессах восстановления и дистилляции титана и редких металлов и подвергающиеся воздействию редкоземельных элементов (класс вредности 2). В данную группу вошли представители следующих профессий: мастера по ремонту оборудования и отделения, печевые, электрогазосварщики, аппаратчики перегонки, нейтрализации и очистки, электромонтёры по ремонту и обслуживанию электрооборудования. На всех обследованных рабочих местах установлено присутствие лантаноидов в воздухе рабочей зоны в концентрациях, не превышающих гигиенических нормативов (ПДК и ОБУВ). Максимальные концентрации в перерасчёте на оксиды определены в диапазонах: для лантана 0,00028–0,0039 мг/м³ (ОБУВ = 6 мг/м³), празеодима 0,000044–0,0007 мг/м³ (ОБУВ = 6 мг/м³), тербия < 0,000007 мг/м³ (ОБУВ = 4 мг/м³), иттрия < 0,00001 мг/м³ (ПДК_м.р. = 2 мг/м³). В группу сравнения вошли 64 сотрудника административной части предприятия (50 женщин и 14 мужчин) в возрасте 48,42 ± 1,63 года, не имевшие профессионального контакта с вредными производственными факторами. Все участники исследования дали добровольное информированное согласие на участие в нём.

Исследование проводилось на образцах периферической крови обследуемых работников. Содержание РЗЭ определяли методом масс-спектрометрии с индуктивно-связанной плазмой (ICP-MS) на приборе Agilent 7900 (Agilent Technologies Inc., США).

Фенотипирование лимфоцитов проводили с применением проточного цитометра FACSCalibur (Becton Dickinson, США) с использованием программного обеспечения CellQuest.PrO. Количественную оценку популяций и субпопуляций лимфоцитов (CD277⁺) выполняли методом мембранной иммунофлуоресценции с регистрацией не менее 10 000 событий.

Для определения концентрации фактора некроза опухоли α (ФНО-α) использовали метод иммуноферментного анализа с тест-системой фирмы «Вектор-Бест» (Россия) на анализаторе TECAN Sunrise (Австрия). Содержание специфического к лантаноидам иммуноглобулина G (IgG) определяли методом аллергосорбентного тестирования с ферментной меткой*.

Экстракцию ДНК из периферической крови осуществляли с использованием набора «ДНК-сорб-B» (НекстБио, Россия). Генотипирование полиморфных вариантов Thr174Met rs4762 гена ангиотензиногена AGT и Cys130Arg rs429358 гена аполипопротеина ApoE проводили методом ПЦР в режиме реального времени на амплификаторе CFX96 (BioRAD, Сингапур) с применением наборов «SNP-скрин» (Синтол, Россия). Протокол амплификации включал этап денатурации при температуре плюс 95 °С в течение 3 мин с последующими 40 циклами при температуре плюс 95 °С (15 с) и плюс 63 °С (40 с).

Статистическая обработка результатов выполнена с использованием пакета Statistica 10.0 (StatSoft, USA). Для анализа данных использованы методы описательной статистики: t-критерий Стьюдента, корреляционно-регрессионный анализ и критерий Фишера. Результаты логистического моделирования представлены коэффициентом детерминации (R²) и уровнем статистической значимости (р). Для оценки связи изучаемых показателей с воздействием факторов рассчитывали отношение шансов (OR) с 95%-м доверительным интервалом (CI) для отношения шансов, а для характеристики риска развития нарушений в условиях химической экспозиции – относительный риск (RR). Различия считали значимыми при р ≤ 0,05.

Результаты

Исследование содержания редкоземельных элементов в организме работников титано-магниевого производства показало выраженное повышение уровней отдельных металлов в сравнении с работниками административного сегмента: иттрия – в 1,5 раза (доля к верхней границе референтного диапазона – 2,12), лантана – в 1,59 раза (доля к верхней границе референтного диапазона – 2,07), празеодима – в 1,46 раза (доля к верхней границе референтного диапазона – 0,67), тербия – в 1,87 раза (доля к верхней границе референтного диапазона – 0,91) (табл. 1).

Сравнительный анализ иммунологических показателей работников группы наблюдения и сравнения предприятия цветной металлургии (вредный производственный фактор – РЗЭ) выявил выраженные признаки дисрегуляции клеточного звена, прежде всего за счёт гиперэкспрессии регуляторного кластера бутирофилина (лимфоцитов CD277⁺). Так, в основной группе абсолютное содержание CD277⁺ превышало показатели группы сравнения в 2,78 раза (p = 0,002), а процентное – в 2,89 раза (p = 0,001) (табл. 2).

Выявлена статистически значимая причинно-следственная зависимость изменений параметров клеточного иммунитета (CD277⁺) от роста концентраций контаминантов в биосредах. Установлено достоверное (p ≤ 0,05) увеличение содержания лимфоцитов CD277⁺ при возрастании концентраций иттрия, лантана (рис. 1), празеодима и тербия в крови (R² = 0,53–0,89) (табл. 3).

Повышенные уровни иммуноглобулина G, специфичного к лантаноидам, выявлены у 60,6% работников основной группы. При этом средние значения данного показателя в группе наблюдения статистически значимо превышали соответствующие показатели группы сравнения в 1,36 раза (p = 0,038). Анализ отношения шансов показал, что воздействие РЗЭ ассоциировано с увеличением вероятности гиперпродукции IgG, специфичного к лантаноидам (OR = 2,38; 95% CI = 1,13–5,01).

Повышенная относительно референтного диапазона экспрессия фактора некроза опухоли зарегистрирована у 33,3% работников основной группы и лишь у 6,7% представителей группы сравнения. При этом уровень данного показателя в группе наблюдения превышал контрольные значения в 4,9 раза (p = 0,004). Оценка отношения шансов показала, что рост концентраций РЗЭ в крови сопровождался существенным повышением уровня ФНО-α у работников группы наблюдения (OR = 7,71, 95% CI = 2,42–24,63).

Установлено, что полиморфизмы генов ангиотензиногена AGT Thr174Met (CT гетерозигота – OR = 2,96, 95% CI = 1,33–6,59, p ≤ 0,05) и аполипопротеина ApoE Cys130Arg (TC гетерозигота – OR = 9,07, 95% CI = 1,93–42,67, p ≤ 0,05) выступают в роли факторов риска развития нарушений, ассоциированных с областью компетенции кандидатных генов. При этом наличие полиморфизма AGT Thr174Met (rs4762) и ApoE Cys130Arg (rs429358) в 4 раза увеличивает риск запуска иммуносопряжённых механизмов формирования сосудистого старения (атерогенеза) у работников основного производства в сравнении с работниками административного аппарата (RR = 2,07–7,25) (табл. 4).

Полученные в рамках проведённого исследования результаты позволили обосновать гипотетический алгоритм формирования раннего сосудистого старения в условиях экспозиции РЗЭ и полиморфизма кандидатных генов (рис. 2).

Обсуждение

Результаты настоящего исследования позволили установить достоверные изменения показателей иммунологического и генетического профилей, которые корреспондируются с научными литературными данными и отражают особенности и модификацию иммуногенетических механизмов атерогенеза (сосудистого старения) у работников предприятий цветной металлургии [10–24]. Согласно проведённым исследованиям, повышенный уровень РЗЭ приводит к увеличению ФНО-α, специфических антител к лантаноидам, экспрессии провоспалительного бутирофилинового рецептора gammadelta Т-лимфоцитов CD277⁺ в условиях полиморфизма генов AGT и ApoE и формированию провоспалительного и проатерогенного статуса у работников основного производства титано-магниевого комбината.

Исследования [10, 11] продемонстрировали, что повышенный уровень провоспалительного цитокина ФНО-α является ведущим медиатором воспаления при болезнях системы кровообращения. ФНО-α может индуцировать дисфункцию эндотелия, способствовать развитию и прогрессированию атеросклероза, а также неблагоприятному ремоделированию сердца после инфаркта миокарда и сердечной недостаточности [12]. Выявленная в нашем исследовании гетерозиготная форма полиморфизма гена AGT Thr174Met (rs4762, CT) напрямую усиливает провоспалительный фон, что подтверждается данными зарубежной литературы. Таким образом, гиперактивация ренин-ангиотензин-альдостероновой системы (РААС) может являться причиной развития артериальной гипертензии, сердечной недостаточности и почечной дисфункции на фоне воспалительного процесса. Важно отметить, что ангиотензин II, конечный продукт этой каскадной реакции, сам обладает провоспалительными свойствами, стимулируя выработку ФНО-α и других цитокинов, создавая тем самым связь «воспаление – гиперактивация РААС – воспаление» [13, 14].

Данные о влиянии РЗЭ на уровень ФНО-α, полученные в нашем исследовании, согласуются с литературными источниками, указывающими на активацию провоспалительных процессов при воздействии производственных химических факторов. В частности, в работе Chen T.H. и соавт. было показано, что хроническое воздействие тяжёлых металлов и промышленных химических агентов значительно повышает уровень TNF-α в сыворотке крови. Это отражает стойкое системное воспаление и нарушение иммунной регуляции у работников, подвергшихся воздействию металлов и токсичных элементов [15].

Выявленная в нашем исследовании избыточная экспрессия CD277⁺ может служить индикатором активации бутирофилинопосредованного провоспалительного пути иммунного ответа гамма-дельта (γδ) Т-лимфоцитов, ассоциированного с эндотелиальной дисфункцией и атерогенезом, у работников, экспонированных лантаноидами (< 0,01 ПДК), что верифицирует сведения, полученные некоторыми авторами [16–18]. C. Harly с коллегами предположили, что CD277⁺ может являться активатором Vγ9Vδ2 T-лимфоцитов – популяции врождённых лимфоцитов, реагирующих на клеточные и метаболические нарушения [16]. По данным других источников установлено, что активация Vγ9Vδ2 T-клеток приводит к гиперпродукции провоспалительных цитокинов, включая ФНО-α [17], что, по мнению ряда авторов, отражает иммунный механизм формирования и роль системы врождённого иммунитета в атерогенезе [18].

Наиболее весомым генетическим фактором риска в контексте нарушений сердечно-сосудистой системы является выявленный в настоящем исследовании у работников, подвергающихся низкоуровневой экспозиции РЗЭ (< 0,01 ПДК), гетерозиготный полиморфизм гена ApoE Cys130Arg (rs429358, TC). Данный генотип, как полагают учёные [19], ассоциирован также с дислипидемией, повышенным риском развития коронарной болезни сердца и цереброваскулярной патологии. В работе И.В. Кудаевой также показано, что у работников, подвергающихся воздействию химических факторов, полиморфизм ApoE Cys130Arg в значительной степени связан с повышенным сердечно-сосудистым риском. Это указывает на модифицирующую роль полиморфизма гена ApoE в развитии сосудистой патологии, вызванной химическими веществами [20].

Хотя прямая связь антител к лантаноидам с конкретными патологиями в научной литературе не описывается, сам факт наличия гуморального иммунного ответа на редкоземельные гаптены свидетельствует о специфической сенсибилизации организма к лантаноидам. Данные научной литературы подтверждают, что хроническая экспозиция лантаноидами в условиях производства способна поддерживать системное воспаление у работников, повышать риск образования иммунных комплексов, создавать предпосылки, способствующие повреждению сосудов. В дальнейшем это приводит к дестабилизации сосудистой стенки и формированию болезней, связанных с условиями труда (сердечно-сосудистая система) [21]. Авторы [22–24] отмечают, что РЗЭ могут вызывать агрегацию воспалительных клеток и высвобождение провоспалительных факторов. Это приводит к нарушениям кроветворной функции и сужению сосудов, оказывает негативное влияние на структуру и функции сердечно-сосудистой системы.

На основании полученных данных и источников научной литературы можно предположить, что экспозиция РЗЭ у работников в условиях генетически модифицированной экспрессии эндотелий-ассоциированных протеинов (полиморфизм AGT и ApoE) формирует хронический иммунный воспалительный ответ с продукцией специфических антител (IgG к лантаноидам), активацией CD277⁺, стойким повышением уровня провоспалительных цитокинов (ФНО-α). В совокупности всё перечисленное характеризует иммуногенетические проявления сосудистого старения и атерогенеза.

Полученные в настоящем исследовании данные свидетельствуют о накоплении РЗЭ в биосредах работников и формировании иммуновоспалительных эффектов при уровне экспозиции, не превышающем действующих гигиенических нормативов (ПДК и ОБУВ). Установленный уровень биоэкспозиции РЗЭ в крови работников, в 1,46–1,87 раза превышающий показатель группы сравнения (p < 0,05), указывает, что даже низкие концентрации РЗЭ в воздухе рабочей зоны (< 0,01 ПДК) формируют опасность кумуляции металлов в организме, а сама низкоуровневая хроническая экспозиция формирует риски развития преморбидных нарушений, которые не отражаются в полной мере при оценке качества рабочей зоны. Представленные результаты демонстрируют достоверные корреляционные связи между концентрациями РЗЭ и экспрессией лимфоцитов CD277⁺ (R² = 0,53–0,89). Наряду с повышением уровней ФНО-α и специфических IgG к лантаноидам это свидетельствует о течении хронического иммунного воспалительного процесса. Одним из факторов, объясняющих развитие выявленных васкулотропных эффектов при нормативно допустимых концентрациях, является генетическая предрасположенность работников. Обнаруженные полиморфизмы генов AGT Thr174Met (rs4762) и ApoE Cys130Arg (rs429358), ассоциированные с повышенным риском сосудистых нарушений (RR = 2,07–7,25), могут существенно модифицировать индивидуальную чувствительность к химическим факторам, поэтому даже низкоуровневая экспозиция способна запускать специфические иммунологические каскады у генетически предрасположенных лиц.

Таким образом, совокупность полученных данных свидетельствует о том, что при хроническом воздействии РЗЭ даже на уровнях ниже гигиенических нормативов возможно формирование избыточной биоэкспозиции с последующим включением иммуногенетических механизмов сосудистого старения.

Ограничения исследования. Ограниченность выборки основной группы работников и числа современных публикаций, посвящённых оценке иммунных механизмов сосудистого старения, ассоциированных с экспозицией РЗЭ.

Заключение

Показано, что работники основного производства в сравнении с работниками административного аппарата имеют повышенную активацию иммунной системы, что подтверждается избыточной экспрессией лиганда ФНО-α [ORт = 7,71 (CI = 2,42–24,63)] и IgG, специфического к лантаноидам [OR = 2,38 (CI = 1,13–5,01)]. Установлены прямые корреляционные связи между концентрациями отдельных РЗЭ (гадолиния, иттрия, лантана, празеодима и тербия) и уровнем провоспалительного атерогенного кластера клеток CD277⁺ (R² = 0,53–0,89 при p ≤ 0,05), сопряжённого с эндотелиальной дисфункцией, что указывает на протективный в отношении сосудистого старения характер специфической экспозиции лантаноидами.

Установленный по результатам проведённого исследования гетерозиготный полиморфизм кандидатных в отношении эндотелиальной дисфункции генов AGT Thr174Met (CT) и ApoE Cys130Arg (TC) у работников основного производства титано-магниевого комбината относится к гипотетическим пусковым факторам риска развития провоспалительных клеточно-васкулярных альтераций. Наличие гетерозиготных вариантов в генотипе значительно увеличивает вероятность развития негативных эффектов (OR = 2,96 и 9,07 соответственно), что почти в 4 раза повышает риск развития нарушений, ассоциированных с областью компетенции кандидатных генов (RR = 2,07–7,25), реализующих иммуногенетический механизм сосудистого старения (ген AGT, ген ApoE).

Выявленные показатели генетического и иммунного статуса могут быть рекомендованы в качестве маркёров эффекта и чувствительности эндотелиальной дисфункции, риска формирования сосудистого старения и атерогенеза для задач ранней диагностики, выявления групп риска и проведения профилактики нарушений здоровья, связанных с условиями труда, у работников производства по восстановлению и дистилляции титана и редких металлов.

* Патент Российской Федерации на изобретение № 2185626 от 20.07.2002 г. «Способ оценки сенсибилизации к металлам-аллергенам». Метод модифицированного конкурентного иммуноферментного анализа изложен в МР 111-14/55-04-02.