Особенности модификации провоспалительного цитокинового профиля химическими и биологическими факторами в эксперименте in vitro (на примере бенз(а)пирена и антигенов вирусов гриппа)

Введение

Практически всё население нашей планеты подвергается воздействию химических загрязняющих веществ в воздухе, нередко превышающему безопасный уровень содержания. Загрязнённый воздух является наиболее значимым фактором риска смертности. По оценкам, до 4,2 млн смертей во всём мире связаны с загрязнением атмосферного воздуха, причинами являются преимущественно болезни сердца, инсульты, хроническая обструктивная болезнь лёгких, рак лёгких и острые респираторные инфекции [1]. Грипп и другие острые респираторные инфекции по-прежнему несут серьёзную угрозу здоровью и благополучию общества, занимая ведущие позиции в структуре заболеваемости населения и определяя значительные социально-экономические потери*.

Цитокины – класс эндогенных медиаторов межклеточного взаимодействия, регулирующих многие физиологические функции и поддержание нарушенного гомеостаза, которые определяют характер протекания патологического процесса при респираторных вирусных инфекциях, координируя иммунные реакции организма на проникающие патогены [2]. Определение уровня цитокинов даёт информацию о функциональной активности различных типов иммунокомпетентных клеток, тяжести воспалительного процесса, его переходе на системный уровень и прогнозе болезни [3]. Несбалансированный цитокиновый ответ с гиперповышением уровня циркулирующих цитокинов (цитокиновый шторм) может привести к повреждению сосудистого барьера, системному воспалению и смерти [4].

Эпидемиологические данные подтверждают роль загрязнения воздуха в повышении риска респираторных вирусных инфекций и нарушении иммунной функции, его потенциального влияния на уровень заболеваемости [5]. Показаны ассоциации экспозиции веществами, загрязняющими атмосферный воздух, с повышенным риском развития и особенностями клинического течения респираторных инфекций, вызванных вирусами SARS-CoV-2, гриппа A, риновирусом, респираторно-синцитиальным вирусом [6]. Возможные пути воздействия связаны с более длительной циркуляцией респираторных вирусов в воздушной среде, изменением восприимчивости организма к инфекции и тяжести процесса и повышением риска сопутствующих болезней. Среди вероятных механизмов называют влияние на респираторную систему с повышением восприимчивости к инфекции, подавление иммунной защиты в результате окислительного стресса, потенцирование вызванного вирусом воспаления тканей, в том числе через стимуляцию провоспалительных цитокинов [7, 8].

Бенз(а)пирен – широко распространённый высокотоксичный загрязнитель окружающей среды, относится к веществам 1-го класса опасности с выраженными канцерогенными свойствами, является продуктом неполного сгорания органических материалов, обнаруживается в промышленных выбросах, выхлопных газах транспортных средств, сигаретном дыме, копчёной и жареной пище. Биологическая активность бенз(а)пирена включает в себя различные молекулярные механизмы, в том числе образование реактивных метаболитов и свободных радикалов, повреждающих ДНК и белки, а также индукцию окислительного стресса, мутагенеза и канцерогенеза, иммуносупрессию [9, 10]. Согласно некоторым данным, тяжесть заболевания вирусными респираторными инфекциями значительно усиливается после контакта с загрязнителем, содержащим бенз(а)пирен. Это вещество способно усугублять патологические эффекты, в том числе вируса гриппа (H1N1), способствуя гипервоспалению дыхательных путей [11].

Многие исследования посвящены изучению роли цитокинов при гриппе разной степени тяжести, однако результаты изучения цитокинового профиля нередко носят противоречивый характер и связаны с половозрастными особенностями и коморбидным статусом пациентов [12]. В то же время научных работ, в которых освещается формирование специфических иммунных фенотипов при гриппе в условиях их дополнительной существенной модификации экспозицией химическими факторами среды обитания, в открытой печати недостаточно, что определяет актуальность данного направления научных исследований.

Цель исследования – оценка особенностей модификации провоспалительного цитокинового профиля химическими и биологическими факторами в условиях экспериментальной модели in vitro (на примере бенз(а)пирена и антигенов вирусов гриппа).

Материалы и методы

Для проведения исследования получали образцы периферической венозной крови условно здоровых доноров мужского пола 25–35 лет (всего 188 проб). Смешанную популяцию иммуноцитов (Т-хелперы, В-клетки, NK-клетки, цитотоксические Т-лимфоциты, моноциты) выделяли на градиенте плотности фиколл-верографин (ρ = 1,077). Клетки инкубировали при температуре плюс 37 °С в течение 48 ч в специализированном CO₂-инкубаторе MCO-5AC (Sanyo, Япония). Продукцию цитокинов индуцировали в условиях воздействия гемагглютининов вирусов гриппа типа А (H1N1 и H3N2) в концентрации 0,1 мкг/см³ и типа В в концентрации 0,22 мкг/см³ (вакцинные вирусные антигены). В качестве химического модифицирующего фактора использовали бенз(а)пирен в концентрации 0,007 мг/дм³ (концентрация подобрана по результатам витального теста). Зависимость концентрации бенз(а)пирена в крови от его содержания в атмосферном воздухе описывали с помощью построения модели линейной регрессии, представленной уравнением (1):

y = а₀ + а₁ x,                                       (1)

где y – содержание химического вещества в крови, мг/дм³; x – концентрация вещества в атмосферном воздухе, мг/м³; а₀ – свободный член (константа), показывающий фоновый уровень вещества в крови при нулевом воздействии из воздуха; а₁ – коэффициент регрессии, показывающий, на сколько единиц изменится концентрация в крови при изменении концентрации в воздухе на единицу.

Концентрации бенз(а)пирена в крови 0,007 мг/дм³ соответствует концентрация бенз(а)пирена в атмосферном воздухе на уровне 0,000002 мг/м³ [13].

Использовали метод иммуноферментного анализа для определения уровней провоспалительных цитокинов (интерлейкинов IL-1β, IL-8, IL-18, интерферона IFN-γ, фактора некроза опухоли TNF-α, моноцитарного хемоаттрактантного белка MCP-1) в собранных супернатантах клеточных культур, использовали коммерческие тест-системы (АО «Вектор-Бест», Россия) в соответствии с методикой, предложенной производителем, измерение проводили на фотометрическом анализаторе Elx808IU (BioTek, США).

Статистическую обработку результатов выполняли в программных продуктах Microsoft Excel 10 и Statistica 10.0 (StatSoft, США). Нормальность распределения проверяли по критерию Шапиро – Уилка, использовали парный t-критерий Стьюдента для оценки межгрупповых различий. Результаты представлены в виде среднего арифметического (M) и стандартной ошибки среднего (m). Различия считали статистически значимыми при уровне р < 0,05.

Результаты

Полученные данные указывают на выраженное стимулирующее влияние антигенов вирусов гриппа на продукцию провоспалительных медиаторов, при этом экспериментальная нагрузка химическим фактором (бенз(а)пирен) существенно изменяла направленность воздействия, модифицируя биологические эффекты вирусных антигенов. Показаны стимулирующие эффекты антигенов вирусов гриппа на уровень IL-1β (рис. 1), в среднем повышение составило в 1,2 раза относительно контрольной пробы (р = 0,015), однако вектор экспрессии менялся на противоположный при одновременном добавлении в культуру клеток бенз(а)пирена, наблюдалось снижение уровня цитокина в 1,29 раза относительно моновоздействия вирусного антигена (р = 0,047). Продукция IL-18 характеризовалась повышением уровня цитокина в условиях воздействия вирусных антигенов гриппа в 1,14 раза (р = 0,041), в присутствии бенз(а)пирена происходил обратный процесс со снижением концентрации показателя до контрольных значений спонтанной экспрессии.

Отмечено повышение уровня IL-8 в присутствии антигенов вирусов гриппа (рис. 2) в 1,28 раза по сравнению с контрольным значением, в то время как бенз(а)пирен оказывал угнетающее воздействие (снижение в 1,35 раза) на продукцию цитокина (p = 0,018–0,035). При совместном присутствии эффекты факторной экспозиции отменялись, и экспрессия IL-8 соответствовала контрольной. Аналогичные эффекты отмечены в отношении модуляции продукции IFN-γ: повышение уровня цитокина в среднем в 1,22 раза в условиях вирусной нагрузки по сравнению с контрольными пробами (р = 0,022), которое сменялось угнетением экспрессии (в 1,5 раза) в присутствии химического фактора бенз(а)пирена (р = 0,039).

Показано значительное повышение экспрессии TNF-α (рис. 3) в присутствии вирусных антигенов (в 3,88 раза относительно контрольного уровня) (р = 0,031). Бенз(а)пирен более выраженно стимулировал продукцию TNF-α – в среднем в 5,21 раза (р = 0,004). Сочетанная экспозиция бенз(а)пиреном и антигенами вирусов гриппа приводила к возрастанию в 1,52 раза уровня TNF-α относительно изолированного воздействия вирусных антигенов (р = 0,033). Уровень хемокина MCP-1 также изменялся в сторону повышения как в присутствии вирусных антигенов (в 1,28 раза), так и в условиях индукции бенз(а)пиреном (в 1,41 раза), эффект сохранялся при сочетанном воздействии факторов (р = 0,001–0,029).

Обсуждение

Цитокины играют важную роль и в защите организма, и в иммунопатогенезе гриппозной инфекции, связанном с нарушением механизмов контроля системного распространения патогенов и развитием цитокинового шторма. Однако нередко исследования по выявлению ведущих медиаторов патологического процесса дают противоречивые результаты ввиду избыточности цитокиновых сигнальных путей, влияния различных штаммов вируса и нарушения иммунных реакций [14]. В целом при гриппе отмечается выраженный провоспалительный профиль секреции цитокинов (IL-6, TNF-α, IL-18, IFN-γ, IL-17A) и хемокинов (IL-8, MCP-1, IFN-γ-индуцированный белок IP-10), который коррелирует с тяжестью болезни [15, 16]. Эти данные корреспондируются с результатами настоящего исследования: в условиях экспериментальных моделей мы отмечали преимущественную активацию экспрессии провоспалительных цитокинов (IL-1β, IL-18, IL-8, IFN-γ, TNF-α, MCP-1).

Согласно научной литературе, результаты изучения механизмов влияния загрязнения воздуха на восприимчивость к респираторным инфекциям позволяют выделить следующие патогенетические особенности, связанные с инфекцией: интенсификация воспаления в слизистых оболочках дыхательных путей, повреждающая нормальную врождённую барьерную защиту; модификация экспрессии клеточных рецепторов, используемых патогенами для инфицирования; снижение противовирусного иммунитета и нарушение элиминирующей функции макрофагов с повышением продукции провоспалительных цитокинов [17]. Согласно некоторым исследованиям, в том числе нашим работам, бенз(а)пирен также проявляет выраженные провоспалительные свойства, действуя через механизм индукции NF-κB и TNF-α, регулирующих экспрессию многих медиаторов воспаления и апоптоз, и способен усугублять клинические проявления респираторных вирусных инфекций [18, 19]. Это подтверждают и результаты настоящего исследования, когда сочетанная экспозиция бенз(а)пиреном и антигенами вирусов гриппа приводила к цитокиновому взрыву преимущественно по критерию лиганда TNF-α, увеличивая его экспрессию в 1,52 раза по отношению к вирус-индуцированному уровню.

Многие опосредованные бенз(а)пиреном эффекты в отношении иммунных клеток реализуются через рецептор ароматических углеводородов (AhR), лиганд-активируемый фактор транскрипции, регулирующий гены метаболизма ксенобиотиков, клеточного цикла и иммунного ответа и являющийся ключевым сенсором химического воздействия на организм [20]. AhR играет регулирующую роль в функциях и ответных реакциях CD4⁺ Т-клеток, дендритных клеток, CD8⁺ Т-клеток и нейтрофилов во время инфицирования вирусом гриппа [21]. В исследованиях показана повышенная чувствительность к бактериальным и вирусным инфекциям и гипервоспалению мышей, дефицитных по AhR. При низкодозовом воздействии бенз(а)пирена наблюдалось формирование противовоспалительного фенотипа активированных макрофагов со снижением экспрессии провоспалительных факторов IL-1β, IL-6, и IL-12, а также длительной персистенцией патогена и развитием хронического воспаления, что корреспондируется с результатами настоящего исследования. Нами установлено, что сочетанные эффекты in vitro бенз(а)пирена и вирусных антигенов приводили к снижению экспрессии цитокина IL-1β в 1,29 раза относительно моновоздействия вирусного антигена. Высокие дозы бенз(а)пирена, значительно превышающие уровень средового воздействия, оказывали более выраженные супрессивные и цитотоксические эффекты [22, 23]. Большое значение имеет выбор экспериментальной модели исследования, действующих концентраций факторов и функциональное состояние клеток, которые могут варьировать направленность эффектов и способствовать повышению опосредованной бенз(а)пиреном иммунотоксичности, что требует дальнейших исследований для подтверждения выдвинутой гипотезы модуляции эффектов вирусной нагрузки низкоуровневой химической экспозицией [24].

Заключение

Полученные результаты экспериментального моделирования условий экспозиции химическими и биологическими факторами в системе лейкоцитарных клеточных культур in vitro показали разнонаправленные эффекты на экспрессию провоспалительных иммунных медиаторов. Экспозиция бенз(а)пиреном вызывала как угнетение (IL-8, в 1,35 раза), так и активизацию (MCP-1, TNF-α, в 1,41–5,21 раза) экспрессии провоспалительных цитокинов по отношению к спонтанному уровню, в то время как экспозиция вирусными антигенами (гемагглютинины вирусов гриппа) приводила к преимущественно стимулирующим цитокинообразование эффектам, которые существенно трансформировались в присутствии химического модификатора бенз(а)пирена. В регионах интенсивного промышленного освоения в условиях достижения в атмосферном воздухе концентраций бенз(а)пирена 0,000002 мг/м³ существует риск негативной модификации течения вирусных инфекций и опасность дополнительного снижения иммунитета за счёт сочетанного воздействия химического фактора.

Таким образом, исследование вариабельности эффектов химических факторов на формирование и трансформацию иммунных фенотипов при сочетанной экспозиции с вирусными антигенами, в том числе с применением экспериментальных подходов in vitro, позволяет расширить представления о механизмах формирования иммунной дисфункции и особенностях модификации цитокинового профиля в условиях экспозиции химическими факторами и использовать данные для разработки и усовершенствования персонализированных и популяционных программ профилактики вирусных инфекций, ассоциированных с дополнительными угрозами и рисками, связанными с экспозицией химическими средовыми факторами (на примере бенз(а)пирена).

* О состоянии санитарно-эпидемиологического благополучия населения в Российской Федерации в 2024 году: Государственный доклад. М.: Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека; 2025. 424 с.