Cronobacter sakazakii и сопутствующие энтеробактерии из сухого детского питания: профиль устойчивости к антибиотикам

Введение

Cronobacter sakazakii – облигатно-патогенный микроорганизм, способный вызывать инфекционные болезни у детей грудного возраста (преимущественно недоношенных, с малой массой тела, ослабленных сопутствующими патологиями), приводить к сепсису, некротизирующему энтероколиту (НЭК) и менингиту. Основной фактор передачи – сухие и восстановленные смеси для искусственного вскармливания, сухое молоко, контаминированное терморезистентными Cronobacter spp., которые могут сохранять жизнеспособность в сухом продукте до двух лет. Есть немногочисленные данные, свидетельствующие о загрязнённости детских смесей кронобактериями, которая составляет в мире 8% [1, 2].

Показатель заболеваемости НЭК среди недоношенных детей достигает 25%, а летальность среди заболевших новорождённых составляет 60%. Частота данных инфекций возрастает по мере распространения искусственного вскармливания. Увеличение числа детей, рождённых на сроках гестации от 22 нед (согласно данным ВОЗ), обусловливает рост значимости данной проблемы. Доза инфекта является экстремально низкой (менее 0,3 КОЕ/г продукта), колонизации возбудителем способствуют не полностью сформированные защитные барьеры кишечника (низкая кислотность желудочного сока, сниженное таксономическое разнообразие кишечной микробиоты и др.), а также отсутствие защитных факторов грудного молока.

Недавние исследования показывают, что виды C. malonaticus, C. turicensis, C. universalis, C. dublinensis, C. muytjensii и C. condimenti потенциально могут вызывать заболеваемость и опасные для жизни осложнения у младенцев и взрослых с ослабленным иммунитетом [3, 4].

Наряду с Cronobacter spp. в сухих продуктах для питания детей обнаруживают и другие энтеробактерии, способные сохранять жизнеспособность при обработке сырья высокими температурами (терморезистентные), некоторые из них относятся к оппортунистическим патогенам. Например, в исследовании [5] оценивалась контаминация на разных стадиях производства. Показано наличие в сухом молоке таких энтеробактерий, как Enterobacter cloacae, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, а также Acinetobacter baumannii. Причём некоторые из них изначально были обнаружены в сырье, что, вероятно, свидетельствует о перекрёстной контаминации сухого продукта из производственной зоны или от персонала.

Поскольку все указанные бактерии способны сохраняться при сушке, есть вероятность наличия у них и других факторов устойчивости, например, антимикробной резистентности (АМР). Однако сведения об этом пока не получены.

Кроме того, в настоящее время недостаточно данных о контаминации Cronobacter spp. и другими терморезистентными бактериями инстантных каш и последующих специализированных смесей в качестве факторов передачи инфекции детям старше 6 мес.

Цель исследования – оценка профиля АМР, в том числе к клинически значимым антимикробным препаратам (АМП), у бактерий C. sakazakii и сопутствующих им энтеробактерий, изолированных из циркулирующих на рынке Российской Федерации сухих продуктов для питания детей раннего возраста.

Материалы и методы

Образцы продуктов. Исследовали 177 образцов продуктов для питания детей. Продукты были приобретены в торговой сети Московского региона за период 2022–2025 гг. Распределение образцов: сухие молочные смеси (СМС) начальные (n = 37) и последующие (n = 21), каши молочные инстантные (n = 61) и безмолочные инстантные (n = 14), компоненты, входящие в состав детского питания, молочные (n = 16) и немолочные (n = 22), каши для варки (n = 6).

Изоляты. Штаммы выделены методом бакпосева с двухстадийным обогащением: навески (3 по 100 г) вносили в предварительно доведённую до температуры плюс 37 °С забуференную пептонную воду (3 колбы по 900 мл) и инкубировали при температуре плюс 37 °С в течение 24 ч, затем пересевали в селективный питательный бульон с ванкомицином (mLST) и инкубировали 24 ч при температуре плюс 44 °С, после высевали на хромогенный агар для выявления Cronobacter spp. Для биохимической идентификации изолятов использовали тест-системы API 20E*. Принадлежность к виду Cronobacter осуществляли методом ПЦР в реальном времени с праймерами, специфичными к роду Cronobacter, видам C. sakazakii, C. malonaticus, C. muytjensii. Всего изучено 65 штаммов: C. sakazakii – 11, C. malonaticus – 3, C. muytjensii – 1, бактерии родов Enterobacter – 9, Klebsiella – 10, Escherichia – 7, Serratia – 6, Pantoea – 9, Enterobacteriaceae с неустановленной принадлежностью – 8, а также Acinetobacter baumannii – 1 [6].

Изучение фенотипа АМР к клинически значимым АМП (пенициллины, монобактамы, фторхинолоны, аминогликозиды, тетрациклины, амфениколы, полипептиды циклические, нитрофураны и макролиды, в том числе высокоприоритетные, критически важные АМП – цефалоспорины, карбапенемы) проводили диско-диффузионным методом (ДДМ) [7].

Для характеристики фенотипа АМР дополнительно рассчитывали индекс множественной резистентности (MAR) по формуле (1):

MAR = a / b,                                      (1)

где a – количество АМП, к которым изолят проявил устойчивость в тесте ДДМ; b – общее количество протестированных АМП [8].

Для оценки степени устойчивости к АМП Cronobacter spp., Klebsiella spp., A. baumannii использовали метод минимальных ингибирующих концентраций (МИК) [7]. В качестве контроля использовали E. coli ATCC 25922.

Изучение АМР в отношении генов, кодирующих БЛРС, – бета-лактамазы расширенного спектра действия (tem, shv, ces, kpc, ctx), карбапенемазы (ges, kpc, oxa) и металло-бета-лактамазы (imp, vim) проводили методом ПЦР с использованием набора БакРезиста GLA. Исследование гена семейства RND, кодирующего эффлюкс АМП из клетки и множественную резистентность adeF, производили с помощью ПЦР в реальном времени с предварительно подобранными специфичными праймерами, с последующим подтверждением в гель-электрофорезе. В качестве контроля использовали музейный штамм лаборатории биобезопасности и нутримикробиома Cronobacter sakazakii.

Статистическая обработка результатов. Для статистического анализа использовали программное обеспечение IBM SPSS Statistics (версия 23) и Microsoft Excel. Статистическую обработку по трём повторностям проводили c расчётом медианы (Me), среднего арифметического (М_ср) и стандартного отклонения от среднего (m).

Результаты

Среди исследуемых образцов продуктов для питания детей, в том числе компонентов для их производства, 8,5% были контаминированы бактериями C. sakazakii в 11 образцах, C. malonaticus – в трёх образцах, C. muytjensii – в одном образце (15 штаммов из 177 образцов). Одновременно 38,4% изучаемых образцов были контаминированы и другими бактериями семейства Enterobacteriaceae, а также рода Acinetobacter. Родовой состав идентифицированных энтеробактерий, в том числе Cronobacter sakazakii, представлен на рис. 1. Среди выделенных штаммов превалировали Cronobacter spp. (21%), другие представители Enterobacteriaceae spp. присутствовали с частотой 11–14%. Наряду с ними был обнаружен штамм Acinetobacter baumannii в образце инстантной молочной каши для питания детей с четырёх месяцев.

Скрининг антимикробной резистентности в тесте ДДМ среди штаммов энтеробактерий выявил наиболее высокий уровень резистентности у Cronobacter spp. и Klebsiella spp., частота встречаемости устойчивых изолятов которых достигала 70–100% (рис. 2).

Среди штаммов C. sakazakii в тесте ДДМ была обнаружена высокая частота АМР к группе бета-лактамных АМП первого поколения (к ампициллину – 46%, ампициллин-сульбактаму – 73%, амоксициллину – 5%), а также к клинически значимым цефалоспоринам III–IV поколений (цефепиму – 50%, цефотаксиму – 27%, цефокситину – 68%, цефтриаксону – 23%), монобактаму азтреонаму – 9%. Наряду с устойчивостью к бета-лактамам в тесте ДДМ проявилась устойчивость к фторхинолонам, ципрофлоксацину (9%), норфлоксацину (50%) и моксифлоксацину (32%); аминогликозидам (амикацину – 36%, гентамицину – 27%, канамицину – 4%), а также доксициклину (32%) и азитромицину (27%), нитрофурантоину (4,5%) и хлорамфениколу (4,5%).

У других представителей Enterobacteriaceae spp., а именно Klebsiella spp., наблюдалась резистентность всех изолятов к ампициллину (100%), амоксициллину (100%), цефокситину (50%), цефепиму и цефотаксиму (17%), цефтриаксону (8%), азитромицину (75%). Также проявлялась устойчивость к фторхинолонам: моксифлоксацину (25% изолятов) и норфлоксацину (67%); аминогликозидам амикацину (50%), гентамицину (42%); доксициклину (33%), нитрофурантоину (8%). При этом все они были чувствительны к азтреонаму, канамицину, колистину, левофлоксацину, стрептомицину, тетрациклину, хлорамфениколу, а также к АМП приоритетной значимости имипенему.

У Enterobacter cloacae, выделенных из растительных компонентов и каш инстантных, отмечена наибольшая частота резистентности к цефалоспорину III–IV поколений: цефотаксиму (42% резистентных штаммов), цефтриаксону (8%), у Pantoea spp. – 30 и 20% соответственно.

Среди Serratia spp. один штамм был устойчивым к цефалоспоринам III–IV поколений.

Все изоляты Cronobacter spp. показали сочетанную устойчивость к двум антибиотикам, а 3 из 15 штаммов (20%) – мультирезистентность к 7 фармгруппам антибиотиков (к 10–13 АМП) (рис. 3). Эти штаммы были выделены из каши молочной инстантной для питания детей с четырёх месяцев, из адаптированной молочной смеси и молочного компонента.

Важно отметить встречаемость среди бактерий рода Klebsiella, которые были устойчивы одновременно к 5–9 АМП (к 3–6 классам антибиотиков). Такую же способность проявлял единичный выделенный штамм A. baumannii.

На рис. 4 отражены показатели АМР у грамотрицательных бактерий, контаминирующих сухие продукты для питания грудных детей, выраженные в виде индекса MAR (мультирезистентности). Самым высоким оказался MAR у штамма A. baumannii – 0,43, далее по убыванию у Enterobacter spp. – 0,35, K. pneumoniae – 0,28, Pantoea spp. – 0,27, Cronobacter sakazakii и Cronobacter malonaticus – 0,26, Escherichia spp. – 0,25. Значения индекса выше 0,2 указывают на высокий уровень резистентности почти у всех исследуемых штаммов и характеризуют штаммы как мультрезистентные.

Таким образом, скрининг позволил выявить высокую частоту нечувствительности кронобактеров и сопутствующих им терморезистентных бактерий к наиболее востребованным в клинике АМП бета-лактамного ряда, фторхинолонам, аминогликозидам, а также наличие мультирезистентных штаммов.

Далее для оценки степени резистентности у C. sakazakii и представителей оппортунистических патогенов Klebsiella spp. и Acinetobacter baumannii были установлены значения МИК (табл. 1). В целом средние значения (М_ср) МИК также были выше к антибиотикам бета-лактамного ряда (см. табл. 1).

Далее по тексту описаны М_ср среди штаммов, проявлявших резистентность: все штаммы C. sakazakii были устойчивы к пенициллину (МИК более 256 мг/л), цефалоспоринам I–II поколений (цефазолину – 16 мг/л, цефуроксиму – 26 мг/л). До 25% исследуемых штаммов были устойчивы к ампициллину, М_ср МИК = 60 мг/л, два штамма C. sakazakii отнесены к резистентным к ампициллин-сульбактаму (М_ср МИК = 24/12 мг/л). Устойчивость к цефтазидиму и цефотаксиму (цефалоспоринам III поколения) обнаружена у 1/3 штаммов, М_ср значения МИК для них составляли 5,6–8 мг/л; устойчивость к цефепиму выявлена у двух штаммов (М_ср МИК = 10 мг/л). К монобактаму азтреонаму 42% устойчивых штаммов, М_ср для них – 10,3 мг/л. Два штамма C. sakazakii отнесены к резистентным АМП последнего резерва карбапенемам (значения их МИК к эртапенему составляло 1 и 2 мг/л). Один штамм, выделенный из каши безмолочной для варки, был устойчив к тигециклину, МИК которого составлял 1 мг/л. Штаммы были чувствительны к пиперациллину (3 мг/л), пиперациллину + тазобактаму, цефоперазону, меропенему, амикацину, ципрофлоксацину, триметоприму + сульфаметоксазолу.

Уровни АМР C. sakazakii к колистину у трёх штаммов превышали значения МИК, М_ср для этой доли резистентных составляло 17 мг/л. М_ср МИК хлорамфеникола среди всех изучаемых кронобактеров составляло 11,77 мг/л, а среди выявленных четырёх резистентных штаммов М_ср МИК – 24 мг/л. Резистентными к азтреонаму оказались семь штаммов, значение М_ср которых составляло 10,3 мг/л, к тетрациклину – два штамма (8 мг/л).

Среди Klebsiella spp. в тесте МИК наблюдалась высокая резистентность к ампициллину (64–128 мг/л), что превышает уровень АМР у C. sakazakii в 10 раз. К ампициллину + сульбактаму – в два раза, пиперациллину в четыре раза. Один штамм Klebsiella pneumoniae, выделенный из сухого молока, имел устойчивость к АМП пенициллинового ряда, цефалоспоринам I и II поколений и полипептиду циклическому. Карбапенем-резистентные клебсиеллы не обнаружены.

Установлен широкий спектр АМР у оппортунистического штамма A. baumannii, выделенного из инстантной молочной каши для питания детей с 4 мес, который проявлял устойчивость к семи группам АМП при скрининге в тесте ДДМ, а в тесте МИК – к шести. Значения МИК для него превышали полученные для целевого патогена C. sakazakii: для ампициллина, цефуроксима и нетилмицина – в два раза; пиперациллина, ципрофлоксацина и хлорамфеникола – в четыре раза; азтреонама – в восемь раз. Штамм был устойчив к эртапенему из группы карбапенемов (1 мг/л).

Поскольку у большинства исследуемых штаммов наблюдали АМР к бета-лактамным АМП, исследование было продолжено для оценки встречаемости в их геноме детерминант, кодирующих факторы устойчивости к современным полусинтетическим пенициллинам и пенемам, – бета-лактамаз расширенного спектра, карбапенемаз и металло-бета-лактамаз (табл. 2). В результате некоторые гены против этих приоритетных АМП обнаружились не у C. sakazakii, а у оппортунистических штаммов K. pneumoniae (изолированы из сухих молочных смесей для детей с рождения, каш инстантных и для варки, компонентов для их производства) и Acinetobacter baumannii (выделен из инстантной каши для детей с четырёх месяцев).

Так, в ДНК шести штаммов клебсиелл (60% исследуемых изолятов) присутствовал ген shv, кодирующий бета-лактамазы расширенного спектра действия, обеспечивающий АМР к большинству пенициллинов и цефалоспоринов, а также часто обладающий ассоциированной резистентностью к АМП других классов. Один изолят из инстантной каши для питания детей с четырёх месяцев наряду с shv содержал ген, кодирующий резистентность к карбапенемам, – oxa-40-like. У штамма A. baumannii обнаружен ген резистентности к АМП приоритетного класса карбапенемов – oxa-51-like.

Других генов БЛРС (tem, ces, kpc, ctx), карбапенемаз (ges, kpc) и металло-бета-лактамаз (ферменты, разрушающие практически все бета-лактамные антибиотики) в ДНК всех выделенных из детских сухих продуктов штаммов кронобактеров, клебсиелл и ацинетобактерий не обнаружено.

Наряду с генами резистентности к бета-лактамным АМП в ДНК шести штаммов C. sakazakii, Klebsiella spp. и Enterobacteriaceae spp. присутствовал трансмиссивный ген adeF, кодирующий выкачивание антибиотиков и других ксенобиотиков из клеток через помпы и обеспечивающий бактериям множественную устойчивость.

Таким образом, нами показана распространённость штаммов АМР в сухих продуктах для питания грудных детей, которая связана в значительной степени с наиболее значимыми АМП бета-лактамного ряда, в том числе последнего поколения. На данном этапе исследование антимикробной резистентности, выделенных штаммов в отношении наличия мобильных генных элементов с генами множественной АМР необходимо продолжить.

Обсуждение

В исследованных сухих продуктах для детского питания наряду с целевыми патогенами рода Cronobacter, устойчивыми к низким показателям массовой доли влаги и повышению температуры при сушке, обнаружены и другие виды энтеробактерий. В их числе идентифицированы представители родов Enterobacter, Klebsiella, Escherichia, Serratia, Pantoea, а также неферментирующих грамотрицательных ацинетобактерий A. baumannii. Ранее нами были отмечены наличие среди E. coli и Enterobacter spp. штаммов, способных при определённых условиях становиться источником распространения терморезистентных клонов, и возможность концентрации Enterobacter spp. под воздействием технологии в заменителях грудного молока и кашах сухих. Также была обоснована необходимость углублённого изучения биологических свойств и факторов патогенности этих контаминантов [9].

Проведённый в настоящей работе анализ профиля АМР у штаммов терморезистентных энтеробактерий подтвердил важность данного направления исследований, поскольку высокая частота обладающих АМР изолятов наряду с Cronobacter spp. была нами установлена и у Enterobacter, и у Klebsiella spp., и у других бактерий, переживших технологические стрессы в продукте.

Так, у C. sakazakii в фенотипе регистрировалась практически тотальная АМР к бета-лактамным антибиотикам первых поколений (пенициллин, ампициллин) и высокая (до 50%) – к современным цефалоспоринам (цефепим, цефотаксим), а у отдельных штаммов – также к препаратам последнего резерва (карбапенемам, тигециклину). При этом у клебсиелл при оценке МИК наблюдался более высокий уровень АМР к препаратам этой группы, чем у Cronobacter spp. (в 2–8 раз), а среди Enterobacter и Serratia spp. обнаружены устойчивые к цефалоспоринам III–IV поколений изоляты. Стоит заметить, что отношение к бактериям рода Serratia как сапрофитным энтеробактериям меняется из-за новых сведений об их роли в патологии. Например, в 2022 г. зафиксировано, что устойчивые к цефалоспоринам S. marcescens стали причиной смертности 7,7% госпитализированных в ОРИТ новорождённых в Эфиопии [10].

Особенно важно, что изоляты всех изученных таксонов показали наличие той или иной частоты множественной АМР (с наибольшим индексом MAR у A. baumannii).

Оценка генного потенциала АМР в отношении клинически значимых бета-лактамов показала: гены БЛРС у резистентных Cronobacter spp. не обнаруживались (хотя это не исключает наличия иных детерминант пенициллинорезистентности), но были выявлены у оппортунистических патогенов K. pneumoniae и A. baumannii. Причём у последнего чётко совпала устойчивость к эртапенему в фенотипе (МИК > 1 мг/л) с присутствием гена карбапенемазы oxa-51-like. Кроме того, в каждом из исследованных таксонов были носители гена adeF, кодирующего эффлюкс чужеродных веществ из клетки и обеспечивающего множественную АМР к тетрациклинам, хлорамфениколу, фторхинолонам, триметоприму, а также к биоцидам, красителям и анионным детергентам [11]. В совокупности эти находки указывают на циркуляцию в продуктах детского питания и компонентах для их производства трансмиссивных генов АМР, способных к активизации при воздействии технологических стрессов. И весьма показательно, что K. pneumoniae относят к возбудителям инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи (ИСМП), а A. baumannii, устойчивые к карбапенемам, возглавляют Список приоритетных бактериальных патогенов ВОЗ на 2024 г. [12].

Важно отметить, что Klebsiella spp., A. baumannii и Enterobacter spp. (штаммы данного рода показали наибольшую частоту АМР к цефалоспорину III–IV поколений в данном исследовании) являются представителями группы оппортунистических патогенов ESKAPE, которые ответственны за большинство ИСМП и расцениваются как взаимосвязанная глобальная угроза и требующая действий проблема в рамках концепции «Единое здоровье» для предупреждения распространения опасной АМР в пищевой цепи [13].

Таким образом, наши результаты ожидаемо подтверждают серьёзный потенциал кронобактеров как возбудителей жизнеугрожающих для младенцев инфекций и заостряют внимание на реальной возможности попадания в продукцию для детского питания сразу нескольких ESKAPE-патогенов (Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Enterobacter spp.), являющихся носителями АМР к наиболее значимым антибиотикам.

В отечественной литературе нет публикаций о сочетанной загрязнённости подобных продуктов кронобактерами и агентами ИСМП, возможно, в силу низкого удельного веса проб детского питания, не соответствующих установленным микробиологическим нормативам в целом. Тем не менее это должно учитываться специалистами, как и тот момент, что такие агенты могут обусловливать тяжёлые внекишечные патологии, которые не связывают с контаминированным детским питанием.

Зарубежные авторы в значительной степени сосредоточены на детальном изучении АМР самих кронобактеров [14, 15]. Так, авторы [15] при оценке фенотипа АМР и скрининге генов АМР и вирулентности путём секвенирования ДНК C. sakazakii, выделенных из пищевых продуктов и мест производства сухого молока, показали, что 9 из 15 изученных штаммов относились к менингитному патовару ST4. Устойчивы к цефалотину были 14 штаммов (93%), к ампициллину – 5 (33%), что согласуется с нашими данными. Обнаружены 20 генов, участвующих в эффлюксе антибиотиков, и 99 генов, кодирующих вирулентность, в том числе биоплёнкообразование (OmpA), сидерофоры и белки стресса; плазмида IncFIB (pCTU3) и мобильные генные элементы ISEsa1, ISEc52, ISEhe3. Авторы заключают, что потенциал проанализированных изолятов обеспечивает им как повышение возможности инфицирования восприимчивых лиц, так и персистенцию в условиях производства сухого молока.

С учётом способности к горизонтальному переносу генов АМР между энтеробактериями (при наличии у них мобильных генов АМР и интеграз) в различных объектах окружающей среды, что показано в работах экологов [16–18], совместную циркуляцию кронобактеров и других энтеробактерий с потенциалом ИСМП в сухих продуктах для детского питания можно признать новым фактором риска для безопасности пищи, который требует разработки актуальных профилактических подходов.

Заключение

При контроле Cronobacter spp. в сухих продуктах для грудных детей целесообразно идентифицировать сопутствующие терморезистентные грамотрицательные бактерии, способные расти на средах для выявления целевых патогенов. При обнаружении среди этих микроорганизмов представителей оппортунистических видов, фигурирующих среди агентов группы ESKAPE, важно изучать наличие у них факторов вирулентности и АМР к клинически значимым АМП для накопления информации о патогенном потенциале данных микробных загрязнителей.

Полученные данные лягут в основу будущих рекомендаций по контролю качества компонентов и эффективности режимов производства сухих молочных смесей и продуктов прикорма в отношении терморезистентных энтеробактерий, у которых устойчивость к технологическим стрессам связана также с устойчивостью к антибиотикам, для снижения рисков попадания болезнетворных патогенов в организм уязвимых категорий населения.

* ГОСТ ISO 22964–2024 Микробиология пищевой цепи. Горизонтальный метод обнаружения Cronobacter spp.