Влияние экспозиции торфяным дымом в ранний постнатальный период на поведение и электроэнцефалограмму взрослых крыс

Введение

Ежегодно в России возникают сотни лесных пожаров, приводящих к интенсивному задымлению городов и посёлков в период с апреля по октябрь. Традиционно исследуется влияние дыма на взрослое население или ликвидаторов пожаров. Однако в равной мере воздействию дымом подвергается и особо чувствительное детское население. Серьёзная проблема накопления химического груза у детей и подростков может быть недооценена с позиции вклада в нарушение здоровья во взрослом возрасте. На современном этапе последствия природных пожаров (ПП) для здоровья населения оцениваются в большей степени в краткосрочной перспективе по показателям смертности и заболеваемости, в то время как отдалённые эффекты воздействия дыма ПП на организм и потомство изучены недостаточно. Дым содержит опасную смесь химических соединений, твёрдых частиц и ультрадисперсных твёрдых частиц PM_2,5, которые негативно влияют на здоровье. Воздействие загрязнения воздуха в течение первого года жизни связано с ухудшением функции лёгких у детей [1–4]. Авторы установили, что воздействие загрязнённого воздуха в младенческом возрасте негативно сказывается на показателе функции внешнего дыхания в возрасте 16 лет, повышая риск клинически значимых нарушений. Количество и разнообразие факторов окружающей среды, с которыми ребёнок сталкивается в первые месяцы и годы жизни, имеют связь с риском развития аллергической сенсибилизации и болезней [5], однако исследования ограничивались лишь достижением подросткового периода ребёнка. Особенно важно выявление критических периодов развития, когда воздействие дыма от лесных пожаров может привести к повышенной чувствительности организма маленьких детей. Установлено, что суммарная химическая нагрузка на растущий организм возрастает с каждым годом начиная с внутриутробного периода [6], однако исследований модифицирующих факторов, влияющих в раннем периоде жизни на риск нарушений здоровья во взрослом возрасте, в настоящее время недостаточно. Чтобы определить эффективные меры, уменьшающие риск развития нарушений здоровья, необходимо понять, как факторы окружающей среды, в том числе дым ПП, влияют на функциональное состояние организма в онтогенезе.

В настоящий период мало что известно о долгосрочных последствиях для здоровья интоксикации дымом лесных пожаров. Мы высказали гипотезу о негативном влиянии дыма лесных пожаров во время беременности или в ранний постнатальный период на функциональное состояние центральной нервной системы (ЦНС) во взрослом возрасте.

Цель настоящего исследования – изучение структуры видоспецифического поведения и биоэлектрической активности головного мозга взрослых крыс, подвергавшихся в ювенильном периоде воздействию торфяного дыма.

Материалы и методы

Экспериментальные исследования выполнены на базе вивария ФГБНУ ВСИМЭИ на 60 белых крысах Wistar обоих полов (масса тела 200–230 г). Животных содержали с 12-часовым светлым/тёмным циклом, регулируемой температурой плюс 22 ± 3 °C и влажностью 60%, со свободным доступом к чистой водопроводной воде и полнорационному гранулированному корму «Дельта Фидс» (АО «БиоПро», Россия). Все экспериментальные животные получены путём собственного воспроизводства в виварии ФГБНУ ВСИМЭИ. Исследование проведено в соответствии с принципами, изложенными в Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях, ETS N 123, ГОСТ 33215–2014 и одобрено Этическим комитетом ФГБНУ «Восточно-Сибирский институт медико-экологических исследований» (протокол № 7 от 15 декабря 2023 г.).

Ингаляционное воздействие торфяным дымом осуществляли в критические периоды онтогенеза (с 23-го по 27-й день жизни). Были сформированы две опытные группы экспериментальных животных по 15 особей в каждой:

• белые крысы-самцы, воздействие торфяного дыма Р23–27 (Опыт 1);
• белые крысы-самки, воздействие торфяного дыма Р23–27 (Опыт 1).

Необходимый уровень задымления достигался в ингаляционных камерах объёмом 200 л путём разбавления дыма чистым воздухом [7]. Режим воздействия торфяного дыма на экспериментальных животных: по четыре часа в день в течение пяти дней. В пробах воздуха каждые 15 мин с помощью газоанализатора ГАНК-4 (НПО «Прибор», Россия) регистрировали содержание кислорода, диоксида углерода, оксида углерода, фурфурола, ацетальдегида, акролеина, сероуглерода, а также концентрацию твёрдых частиц диаметром менее 2,5 мк (РМ_2,5) с использованием анализатора аэрозоля DustTrak 8533 (TSI Inc., США). Контрольная группа крыс не подвергалась ингаляционному воздействию торфяным дымом и также состояла из подгруппы самцов и подгруппы самок (по 15 особей в каждой). При ингаляционном воздействии поддерживался целевой уровень монооксида углерода (СО), медианное значение и интерквартильный размах которого составляли 21 (13; 28) мг/м³. Данный уровень воздействия торфяного дыма был выбран нами как часто встречающийся в населённых пунктах при загрязнении дымом лесных пожаров, не вызывающий отравления у крыс, а также близкий к предельно допустимой концентрации в рабочей зоне [8]. Содержание О₂ поддерживалось притоком чистого воздуха и не снижалось в течение экспозиции ниже 18,7%, медианное значение концентрации СО₂ не превышало 0,17%. Концентрация твёрдых частиц диаметром менее 2,5 мк (РМ_2,5) в среднем составляла 0,09 (0,04; 0,19) мг/м³.

В возрасте трёх месяцев у крыс оценивали функциональное состояние ЦНС. В исследование входили тестирование поведения животных в «открытом поле», оценка результатов электроэнцефалограммы (ЭЭГ) и гистологический анализ коры головного мозга. Установка «открытое поле» представляла собой круглую арену диаметром 110 см с полупрозрачным полом и бортиками высотой 40 см с инвертированным освещением и системой компьютерной регистрации EthoStudio (Россия) [9]. Животное помещали около стенки и в течение трёх минут регистрировали пройденный путь, площадь исследованной арены, вертикальную активность и время нахождения в центре арены.

Для оценки функциональной активности головного мозга проводили регистрацию ЭЭГ с использованием портативного восьмиканального ветеринарного компьютерного электроэнцефалографа «Нейрон-Спектр-1/В» («Нейрософт», Россия). Для ограничения движения во время размещения электродов и записи ЭЭГ животным вводили подкожно 0,1%-й раствор медетомидина гидрохлорида в дозе 0,01 мг/кг. Запись ЭЭГ проводилась в затемнённой тихой комнате. Использовали тонкие игольчатые электроды: 1) два регистрирующих электрода вводили подкожно в области левого и правого полушарий теменной части головы; 2) референтный электрод вводили подкожно в области носовой кости; 3) заземляющий электрод фиксировали на хвосте. Регистрировали ЭЭГ в режиме фоновой пробы в течение 60 с. При записи ЭЭГ границы фильтров высоких и низких частот составляли 0,5 и 35 Гц, частота дискретизации – 200 с⁻¹. Деление на диапазоны проводили в пределах следующих значений частот: δ-диапазон – 0,5–4 Гц; θ-диапазон – 4–8 Гц; α-диапазон – 8–13 Гц; β1-диапазон – 13–22 Гц; β2-диапазон – 22–32 Гц. Длительность эпох анализа составляла 10 с. Оценивали следующие нейродинамические параметры ЭЭГ: амплитуда каждого диапазона (δ, θ, α, β1 и β2); мощность диапазонов, которая выражалась в относительных величинах мощности как доля (в %) от общей мощности спектра; индекс каждого ритма (процент времени записи, во время которого фиксировалась активность соответствующего частотного диапазона по отношению ко всему времени записи). После окончания обследований животные были выведены из эксперимента путём декапитации под лёгким эфирным наркозом.

После этого головной мозг каждого исследуемого животного был извлечён и фиксирован в нейтральном буферном растворе формалина (10%), обезвожен этанолом восходящей концентрации (70; 80; 90; 95 и 100%) и помещён в гомогенизированную парафиновую среду для гистологических исследований HistoMix (BioVitrum, Россия). Далее приготовленные с помощью микротома МС-1 (Россия) серийные фронтальные срезы головного мозга толщиной 4–5 мкм на уровне Bregma-6,10 мм, Interaural 3,90 мм окрашивали на обычных гистологических предметных стёклах крезиловым фиолетовым по методу Ниссля. Была изучена нервная ткань височно-теменной зоны сенсомоторной коры головного мозга как нервный центр, обеспечивающий регуляцию основных физиологических функций организма и сложные формы поведения. В окрашенных срезах головного мозга подсчитывали общее число нейронов на единицу площади, клеток глии, дегенеративно изменённых нейронов (дегенеративно изменёнными считали тёмноокрашенные нейроны без чётко различимого ядра и цитоплазмы) и число актов нейронофагии. Полученные срезы изучали при помощи светооптического исследовательского микроскопа Olympus BX 51 (Япония) с вводом микроизображений в компьютер при помощи камеры Olympus E420 (Япония). Применяли пакет прикладных программ Image Scope M.

Для статистической обработки результатов исследования использовали пакет прикладных программ Statistica 6.1 Stat Soft Inc. (США) (лицензия № AXXR004E642326FA, правообладатель лицензии ФГБНУ ВСИМЭИ). Для принятия решения о виде распределения признаков использовали W-критерий Шапиро – Уилка, для сравнения независимых групп применяли U-критерий Манна – Уитни. Результаты представлены в виде медианы и интерквартильного размаха Me (Q₁; Q₃).

Результаты

Анализ результатов тестирования поведения животных в тесте «открытое поле» свидетельствовал о наличии гендерной чувствительности к воздействию торфяного дыма у белых крыс. У экспонированных дымом самцов белых крыс наблюдались статистически значимые изменения показателей индивидуального видоспецифического поведения (табл. 1), в то время как двигательная активность самок, подвергавшихся воздействию торфяного дыма в раннем постнатальном периоде, по исследуемым показателям не отличалась от контрольной группы (см. табл. 1).

Самцы опытной группы практически не выходили в центр, что свидетельствовало о значительном повышении уровня их тревожности. Среднее значение времени пребывания в центральной части арены было снижено в 10,7 раза (р = 0,015; см. табл. 1). Кроме того, у самцов, подвергавшихся воздействию торфяного дыма в раннем постнатальном периоде, наблюдалось выраженное снижение исследовательской активности. Площадь исследованной арены у данных особей была на 27% ниже соответствующего показателя животных контрольной группы (р = 0,017). Выявленные изменения видоспецифического поведения крыс-самцов могут являться показателем повышенной стрессированности и тревожности.

При анализе результатов ЭЭГ животных опытных и контрольных групп, подвергавшихся воздействию торфяного дыма в ювенильном периоде, выявлены различия в биоэлектрической активности у взрослых самцов и самок. Снижение амплитудных характеристик ЭЭГ самцов, подвергавшихся воздействию дыма в раннем пренатальном возрасте, происходило в основном за счёт снижения средних амплитуд дельта- и тета-ритмов. Снижение средней амплитуды дельта-ритма опытных самцов составило 43 и 50% в левом и правом полушариях мозга соответственно (р = 0,038 и р = 0,007; табл. 2). Амплитуда тета-ритма в левом полушарии была снижена на 9% по сравнению с контролем (р = 0,007), в правом полушарии – на 8% (р = 0,026; см. табл. 2).

Анализ основных ритмов ЭЭГ показал, что у самцов белых крыс индекс дельта-ритма в обоих полушариях также имел тенденцию к снижению (р = 0,053; см. табл. 2). У самцов опытной группы в левом и правом полушариях наблюдалось статистически значимое снижение индексов тета-ритма на 40–48% по сравнению с группой контроля (р = 0,002 и р = 0,001 соответственно). Представленность высокочастотного бета-ритма у них превышала показатели контрольной группы. В левом полушарии данные изменения имели высокую статистическую значимость (р = 0,005).

У взрослых самок белых крыс выявлено статистически значимое превышение средней амплитуды высокочастотного бета-ритма в правом и левом полушариях на 75–82% (р = 0,002 и р = 0,005 соответственно; см. табл. 2). Средняя амплитуда низкочастотного бета-ритма в обоих полушариях была повышена на 29–30% относительно контроля, однако статистическую значимость наблюдаемые изменения имели лишь в левом полушарии (р = 0,002). Изменения амплитудных характеристик в других диапазонах волн на ЭЭГ самок белых крыс не выявлены. У этих же самок наблюдалось достоверное повышение индекса представленности высокочастотного бета-ритма в обоих полушариях в 1,8–2 раза (р = 0,022; см. табл. 2).

Результаты гистологической и морфометрической оценки состояния сенсомоторной коры головного мозга белых крыс при воздействии дыма торфяных пожаров не отличалась от контрольных значений. Кровенаполнение сосудов вещества мозга животных опытной группы было в норме. Сосудистые стенки не имели изменений (табл. 3).

Обсуждение

В ряде регионов Российской Федерации (Якутия, Забайкальский край, Республика Бурятия, Дальний Восток и др.) масштабные природные пожары происходят регулярно, в пожароопасный период население ежегодно подвергается воздействию продуктов горения, поэтому исследования воздействия дыма лесных пожаров в долгосрочной перспективе имеют высокую значимость. Дым от лесных пожаров представляет собой сложную химическую смесь газов и мелких частиц и является одним из основных источников твёрдых частиц, в том числе мелкодисперсных (PM_2,5) [10], которые, по мнению [11], стали причиной более 8,8 млн преждевременных смертей по всему миру. Эпидемиологические исследования [3, 12, 13] доказывают, что воздействие лесных пожаров, дыма от сжигания древесины и биомассы повышает риск респираторных инфекций и снижения функции лёгких у детей и подростков. Острые последствия лесных пожаров или сжигания биомассы в некоторой степени изучены, однако влияние компонентов дыма, в том числе и твёрдых частиц, внутриутробно или в раннем детстве и долгосрочные последствия воздействия изучены недостаточно. Особенно значимы критические периоды развития, когда интенсивное воздействие может формировать повышенную чувствительность и обусловливать нарушения здоровья во взрослом возрасте. Ранний постнатальный период, вероятно, является критическим периодом восприимчивости дыхательной системы к загрязнению воздуха [14]. Эмбриональный и ранний постнатальный периоды онтогенеза исключительно важны и в динамике развития головного мозга. Формирование и свойства этого органа определяются не только генетическими факторами, но и средой, создаваемой в комплексе с внешними факторами [15]. В исследованиях мы придерживались следующей возрастной периодизации развития белых лабораторных крыс: новорождённые (1–2-я недели), 1 мес (ранний постнатальный), 6 мес (репродуктивный), 12 мес (зрелый), 2 года (старческий) [16]. При этом периоды новорождённости и ранний постнатальный условно именуются критическими периодами онтогенеза белых крыс. Неблагоприятные воздействия в данный высокочувствительный для мозга период могут нарушать нормальное развитие нервной системы, созревание коры головного мозга и вызывать необратимые последствия [17]. Одним из таковых может стать пребывание в раннем постнатальном возрасте в среде с высокой степенью или длительностью задымления от природных пожаров. К возможным механизмам негативных эффектов дыма от лесных пожаров относится способность твёрдых частиц вызывать сочетание окислительного стресса и воспаления, что может дополнительно вызывать физиологические [18–20] или эпигенетические изменения [21, 22]. Анализ результатов проведённого моделирования интоксикации торфяным дымом в ранний постнатальный период подтвердил высказанную гипотезу о длительных негативных последствиях воздействия задымления для ЦНС. Нами были оценены последствия экспозиции торфяным дымом белых крыс в критический период онтогенеза на функциональное состояние нервной системы взрослых особей. Анализ результатов тестирования белых крыс в условиях «открытого поля» показал повышенную чувствительность к воздействию торфяного дыма, имеющую явно выраженные гендерные отличия. У самцов, подвергшихся воздействию торфяного дыма, были выявлены значительные отклонения видоспецифического поведения, в то время как структура поведения опытных самок не отличалась от контрольных. Самцы демонстрировали резкое сокращение пребывания в центре арены и уменьшение площади исследования, что свидетельствует об угнетении активно-поисковой составляющей поведения. По мнению авторов [23, 24], угнетение двигательной активности относится к проявлениям защитного торможения, которое возникает у животных в ответ на развивающийся стресс. Существенное снижение исследовательской активности у половозрелых самцов (3–3,5 мес), подвергавшихся воздействию торфяного дыма в ранний постнатальный период, может свидетельствовать о возможном нарушении адаптационных механизмов организма, сохраняющемся длительный период.

Известно, что формирование активности основных ритмов ЭЭГ в основном происходит в первый месяц постнатального онтогенеза животных. Среди признаков зрелости в динамике биоэлектрической активности головного мозга важную информацию несёт частотно-амплитудный спектр ЭЭГ. Гендерные различия у крыс в половозрелом возрасте выявлены и при изучении результатов электроэнцефалографии. Последствия экспозиции торфяным дымом имели разнонаправленное действие на ряд показателей спектральных характеристик ЭЭГ у самцов и самок белых крыс. У самцов наблюдали снижение амплитудных характеристик ЭЭГ, происходившее в основном за счёт волн низкочастотного диапазона (дельта- и тета-ритмы). Известно, что во время поисково-исследовательской активности во всех отведениях и особенно в области теменной коры над гиппокампом начинают доминировать тета-ритмы. Полученное в нашем эксперименте уменьшение амплитуд волн дельта- и тета-ритмов во многом обусловливает снижение исследовательской активности и повышенную тревожность самцов белых крыс, наблюдаемые при тестировании в «открытом поле».

В отличие от самцов у особей женского пола наблюдалось повышение амплитуды и индекса в большей степени за счёт быстроволновой активности бета-ритма, то есть спектр ЭЭГ сдвигался в сторону более высокочастотных ритмов, и, следовательно, повышался уровень активации. Выявленные нами неспецифические изменения амплитуды и индекса основных ритмов во всех диапазонах могут свидетельствовать о формировании в мозге половозрелых животных с экспозицией дымом природных пожаров в ранний постнатальный период нового уровня функциональной активности. Возможно, это обусловлено активацией как процессов возбуждения, так и торможения, что подтверждается разнонаправленными показателями биоэлектрической активности головного мозга у самцов и самок. С позиции гендерной чувствительности можно сделать вывод о том, что наиболее выраженные изменения значений спектров ЭЭГ наблюдались у особей мужского пола.

Результаты гистологического анализа ткани коры головного мозга не выявили нарушений в структуре нервной ткани. Вероятно, последствия экспозиции имели в большей мере функциональные проявления со стороны нервной системы, которые отражались в изменении показателей ЭЭГ. Известно, что ранний постнатальный период характеризуется нейропластичностью и высокой адаптивностью к воздействию, в связи с чем воздействие дыма не вызвало морфологических изменений нервной ткани. Таким образом, воздействие дыма природных пожаров в ранний постнатальный период, когда происходит становление и формирование биоэлектрической активности головного мозга, приводит в течение онтогенеза к патологическим изменениям электроэнцефалографии у взрослых самцов белых крыс. Данные нарушения лежат в основе изменения видоспецифического поведения.

Заключение

Анализ особенностей биоэлектрической активности головного мозга крыс позволил оценить отдалённые последствия воздействия дыма природных пожаров у взрослого индивида после экспозиции в раннем постнатальном периоде.

В целом результаты проведённых исследований свидетельствуют о следующем.

1. Онтогенетическими особенностями крыс, перенёсших в раннем постнатальном периоде воздействие дымом природных пожаров, является изменение функционального состояния ЦНС.

2. Дым природных пожаров как неблагоприятный фактор среды, воздействующий в ранние постнатальные периоды, способствует нарушению амплитудно-частотных свойств суммарной биоэлектрической активности коры мозга у взрослых половозрелых особей.

3. Наиболее существенные сдвиги в видоспецифическом поведении и биоэлектрической активности мозга проявляются у самцов белых крыс.