Разработка видоспецифичных праймеров и зондов in silico для выявления пародонтопатогенов

Введение

В последние два десятилетия профилактика вирус-, бактериально- и грибково-обусловленных форм рака смещается от универсальных санитарных мероприятий к адресным системам контроля, основанным на количественной гигиенической донозологической оценке риска. Именно риск-ориентированный подход позволяет выстроить гибкую, экономически оправданную и научно обоснованную систему мониторинга, приоритетно фокусируясь на наиболее значимых микробных факторах канцерогенеза. Этот метод обеспечивает научно обоснованный мониторинг ещё до появления клинических признаков болезни.

Полость рта человека заселена богатым микробиомом, включающим более 1000 видов бактерий из филумов Actinobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes, Proteobacteria, Spirochaetes и др. Эти микроорганизмы участвуют в поддержании гомеостаза, метаболизме и защите от патогенов [1]. Основная масса видового состава (более 75%) нормальной микрофлоры полости рта представлена микроорганизмами с преимущественно анаэробным типом дыхания. При дисбиозе микробного сообщества развивается хроническое воспаление: нарушается целостность эпителия, активируются продукция провоспалительных цитокинов и деструкция тканей. Это способствует развитию кариеса, пародонтита, слизистых дисплазий, рака слизистой оболочки полости рта, а также влияет на отдалённые хронические неинфекционные болезни (сердечно-сосудистые, диабет и др.) [1]. Формирование орофарингеальной микробиоты начинается при рождении и продолжается в течение жизни. Необходимо отметить, что микробиота полости рта частично может передаваться от человека к человеку контактно-бытовым путём, становясь микробным фактором, который требует гигиенической донозологической оценки. Передача может осуществляться различными способами: через поцелуи, использование общих предметов личной гигиены (зубных щёток, полотенец), а также через капли слюны при разговоре и кашле [2].

Медикаментозные вмешательства могут существенно изменять орофарингеальный микробиоценоз. Некоторые препараты провоцируют пародонтальные изменения. Так, длительный приём фенитоина, циклоспорина и блокаторов кальциевых каналов вызывает гиперплазию дёсен, а глюкокортикостероида дексаметазона – усиленную резорбцию костной ткани [3, 4]. Системная антибиотикотерапия приводит к нарушению кишечной микробиоты и опосредованно к изменению состава микробов во рту: потеря разнообразия микробов и рост устойчивых штаммов усугубляют воспаление пародонта [5]. Химиолучевая терапия при опухолях головы и шеи также значительно сокращает разнообразие ротовой микробиоты и изменяет её структуру. Например, после химиолучевой терапии отмечается уменьшение численности Porphyromonadaceae и Prevotellaceae при одновременном росте Lactobacillaceae [3].

Для слизистой оболочки полости рта применение риск-ориентированного подхода стало особенно актуальным: в настоящее время активно обсуждается роль микробного фактора – предиктора развития как первичных злокачественных опухолей этой локализации, так и рецидивов [6]. Хронический дисбиоз микробного сообщества сопровождается постоянным воспалением и нарушением иммунного надзора. При дисбиозе усиливается сигнализация через NF-κB/STAT3, активно выделяются цитокины (IL-6, TNF-α и др.) и металлопротеиназы, что стимулирует пролиферацию эпителиальных клеток и локальную иммуносупрессию [7]. Нарушение баланса микробов изменяет соотношение Th17/Treg-клеток, уменьшает эффективность распознавания патогенов через TLR-пути и может подавлять цитотоксические NK/T-лимфоциты [8]. Эти процессы создают фон для канцерогенеза: бактериальные токсины и метаболиты (например, ацетальдегид) повреждают ДНК клеток, а постоянная активация провоспалительных каскадов препятствует апоптозу диспластических клеток [7].

Ключевыми пародонтопатогенами являются представители «красного комплекса» – Porphyromonas gingivalis, Treponema denticola и Tannerella forsythia. Эти бактерии часто встречаются совместно в глубоких зубодесневых карманах и играют ключевую роль в деструкции пародонта у восприимчивых лиц [9]. Присутствие данных микроорганизмов ассоциировано с предраковыми изменениями слизистой и развитием рака полости рта. В тканях плоскоклеточной карциномы ротоглотки существенно повышена доля P. gingivalis и T. denticola, а также других анаэробов (Fusobacterium, Prevotella intermedia и др.) [10–13].

Prevotella intermedia в норме распространена в десневых карманах, но обнаруживается в повышенных концентрациях уже на ранних этапах канцерогенеза слизистой оболочки полости рта [13]. Современные исследования показали, что этот микроорганизм также ассоциирован с развитием рака слизистой оболочки полости рта. Следовательно, первоочередная задача санитарного надзора заключается не в сплошном контроле всей микробиоты, а в ориентировании диагностических мероприятий на узкий круг канцерогенных видов, что представляется экономически обоснованным и клинически целесообразным.

P. gingivalis, T. denticola, T. forsythia и P. intermedia вызывают хроническое воспаление в полости рта, что приводит к продукции провоспалительных цитокинов, таких как IL-1β, IL-6 и TNF-α, а также к активации металлопротеиназ (MMP-8, MMP-9) и ремоделированию внеклеточного матрикса [7]. Хроническое воспаление способствует мутагенезу, ангиогенезу и нарушению процессов апоптоза, создавая условия для злокачественной трансформации клеток [14]. P. gingivalis обладает выраженным антиапоптотическим действием. Этот микроорганизм ингибирует апоптоз эпителиальных клеток посредством активации сигнальных путей Jak1-Stat3 и модуляции экспрессии микроРНК (например, повышение экспрессии miR‑203), что способствует выживанию и пролиферации клеток с повреждённым геномом [14, 15]. T. denticola выделяет химотрипсиноподобную протеиназу (Td-CTLP), которая активирует металлопротеиназы, способствует инвазии опухолевых клеток и разрушению внеклеточного матрикса [16]. Кроме того, указанные бактерии продуцируют летучие соединения серы, органические кислоты и ацетальдегид, обладающие генотоксическим и канцерогенным действием [15]. P. intermedia и другие представители «красного комплекса» способны разрушать иммуноглобулины и компоненты комплемента, что способствует иммуносупрессии и хронизации воспаления [17, 18]. T. forsythia индуцирует апоптоз клеток и продуцирует ферменты, коррелирующие с клинической тяжестью воспаления и канцерогенезом. Все перечисленные бактерии способны изменять локальный иммунитет, снижая противоопухолевую защиту и способствуя выживанию мутированных клеток [7, 8]. В ряде исследований приводятся данные о повышенном содержании P. gingivalis, P. intermedia, T. forsythia и T. denticola в слюне и опухолевой ткани пациентов с плоскоклеточным раком слизистой оболочки полости рта по сравнению со здоровыми добровольцами [14, 19]. Метаанализы и экспериментальные исследования подтверждают, что наличие этих бактерий ассоциировано с более высокой частотой предопухолевых изменений и злокачественных трансформаций эпителия полости рта. Так, показано, что присутствие P. gingivalis увеличивает риск плоскоклеточной карциномы слизистой оболочки полости рта примерно в 1,36 раза [20].

Ранняя диагностика и точная идентификация пародонтопатогенов имеют важное гигиеническое значение. Это позволяет своевременно оценить микробиологический профиль полости рта у пациентов из группы риска, выявить предрасположенность к развитию злокачественных изменений и рецидивов опухоли, а также осуществлять целенаправленный микробиологический контроль и профилактику, включая коррекцию микробиоты и санацию полости рта до и после лечения. Использование ПЦР-панели снижает стоимость диагностики при одновременном росте выявляемости опасных колонизаций. Это высвобождает ресурсы для таргетированной санации и сокращает осложнения, связанные с образованием биоплёнок.

Выявление указанных микроорганизмов в клинической практике сопряжено с рядом трудностей. Традиционные микробиологические (культуральные) методы обладают низкой чувствительностью и специфичностью, не позволяют обнаруживать труднокультивируемые или облигатно-анаэробные виды, требуют значительного времени для получения результата. Для эффективного выявления пародонтопатогенов необходимы современные методы диагностики. К таким методам предъявляются требования быстроты получения результата, высокой чувствительности и специфичности для всех ключевых пародонтопатогенов, возможности количественной гигиенической донозологической оценки бактериальной нагрузки, а также автоматизации и стандартизации процесса для широкого внедрения в клиническую практику. Совокупность перечисленных преимуществ делает полимеразную цепную реакцию (ПЦР) методом выбора для выявления пародонтопатогенных микроорганизмов.

В настоящее время в мировой и отечественной практике разработаны коммерческие тест-системы для ПЦР-детекции пародонтопатогенов. Среди зарубежных наборов следует выделить micro-IDent^®plus11 (Hain Lifescience, Германия) для идентификации 11 видов пародонтопатогенных бактерий после двух ПЦР-раундов и последующей обратной гибридизации, набор Carpegen^® Perio Diagnostik (Carpegen GmbH, Германия) для количественной ПЦР в реальном времени шести пародонтопатогенов, набор ParoCheck^® Kit 20 (Greiner Bio-One, Германия) для детекции 20 бактериальных видов, а также набор AID PeriodontitisPlus Kit (AID Diagnostika, Германия) для идентификации 12 основных маркёрных бактерий пародонтита, а также генотип интерлейкина-1 и аллель HLA-DR4 [21–23]. В Российской Федерации наибольшее распространение получил набор реагентов «Мультидент-5» (ООО «НПФ «Генлаб», Россия), предназначенный для одновременной детекции методом ПЦР ДНК пяти пародонтопатогенов (P. gingivalis, P. intermedia, T. denticola, T. forsythia и Aggregatibacter actinomycetemcomitans) [24]. Однако данный набор базируется на классической ПЦР-амплификации с регистрацией результатов электрофорезом, что позволяет получать лишь качественную или полуколичественную картину патогенной микрофлоры и несёт риск контаминации ампликонами из-за пост-ПЦР обработки [25]. Также в России разработан набор ParodontoScreen (ООО «НПО ДНК-Технология», Россия) для количественного ПЦР-анализа в реальном времени оппортунистических микроорганизмов, населяющих полость рта [26]. Все перечисленные системы имеют прикладной клинический характер и направлены на диагностику пародонтита, но не являются нацеленным инструментом для гигиенической донозологической оценки риска развития злокачественных новообразований слизистой оболочки полости рта.

Цель настоящего исследования – подбор in silico видоспецифичных праймеров и зондов для мультиплексной ПЦР в реальном времени, которые после клинической валидации могли бы использоваться для количественной гигиенической донозологической оценки риска развития рака слизистой оболочки полости рта и других воспалительных патологий у здоровых людей.

Материалы и методы

Получение и подготовка геномов. Полные геномные последовательности Porphyromonas gingivalis, Treponema denticola, Tannerella forsythia и Prevotella intermedia, находящиеся в открытом доступе, были получены из базы данных NCBI RefSeq (при помощи Entrez query вида Porphyromonas gingivalis [Organism] AND «complete»[All Fields]). Геномы были отформатированы для совместимости с инструментами выравнивания с помощью BioPython v1.78.

Определение консервативных участков. Консервативные участки генома всех четырёх целевых видов были идентифицированы с помощью Mauve v2.4.0 [1] с параметрами по умолчанию (автоматическим выбором seed weight, порога оценки LCB и минимального балла LCB). Использовался алгоритм progressiveMauve, с помощью которого были извлечены локально коллинеарные блоки (LCB), которые являются общими внутри исследуемых геномов для данного вида. Регионы, имеющие высококонсервативную последовательность, были сохранены для дальнейшего анализа.

Сравнительный анализ с родственными таксонами. Консервативные LCB сравнивали с геномами филогенетически родственных видов (например, Porphyromonas gulae и других Porphyromonas spp., Treponema pallidum, Treponema socranskii, Treponema vincentii, Tannerella buccae и Prevotella nigrescens) с помощью BLASTn v2.12.0 [27]. Последовательности с высокой идентичностью (≥ 85%) с нецелевыми видами были исключены с целью обеспечения уникальности для целевых патогенов.

Разработка праймеров. Работа с полученными последовательностями и подбор видоспецифичных праймеров в сохранённых областях проводились с использованием Geneious Prime^® 2020.2.5 (Biomatters Ltd.). Параметры включали: размер ампликона 80–180 bp, длину праймеров 18–22 bp, температуру плавления T_m плюс 58–62 °C (ΔT_m ≤ 0.5 °C), содержание GC 40–60% и стабильность 3’-конца ΔG ≥ − 9 ккал/моль. Для зонда длина была выбрана в диапазоне 23–28 bp и T_m, превышающая минимум на 4–5 °C среднюю T_m для пары праймеров. Вторичные структуры, образование димеров и температура плавления оценивались с использованием встроенных инструментов Geneious и IDT OligoAnalyzer [28].

Проверка специфичности in silico. Специфичность праймеров оценивали с помощью программы NCBI Primer-BLAST [29] по базе данных nt. Праймеры, дающие непредусмотренные ампликоны (в том числе с нецелевыми организмами), подвергали итеративной переделке до подтверждения специфичности.

Результаты

В рамках исследования были подобраны следующие наборы праймеров для каждого из четырёх целевых видов: Porphyromonas gingivalis, Treponema denticola, Tannerella forsythia и Prevotella intermedia (см. таблицу).

В рамках проведённого исследования были разработаны специфические последовательности праймеров для детекции и идентификации ключевых видов пародонтопатогенов. Для Porphyromonas gingivalis созданы два независимых набора праймеров: один нацелен на ген rgpA, второй – на консервативный участок 16S рРНК. Оба набора демонстрируют высокую специфичность с температурой плавления праймеров в диапазоне плюс 61,2–61,7 °C и длиной ампликонов 91 и 179 пар нуклеотидов (п.н.). Для Prevotella intermedia и Tannerella forsythia разработаны праймеры, амплифицирующие участки 16S рРНК с длиной продуктов 82 и 132 п.н. соответственно. Для детекции Treponema denticola создан набор с длиной ампликона 86 п.н. и температурой плавления плюс 62,1–62,6 °C.

Полученные последовательности зондов обеспечивают возможность применения четырёхплексной ПЦР с использованием флуоресцентных меток (FAM, JOE, ROX, Cy5) и соответствующих тушителей сигнала (BHQ1, BHQ2, BHQ3), Использование зондов, меченных разными флоурофорами с неперекрывающимися спектрами эмиссии, позволяет проводить количественную оценку полибактериальной нагрузки в режиме реального времени у здоровых людей.

Подобранный набор праймеров и зондов после экспериментальной и клинической валидации может стать основой для точной идентификации и количественной оценки патогенных микроорганизмов, что открывает новые возможности для донозологической диагностики и мониторинга состояния микробиоты полости рта.

Обсуждение

В рамках реализации риск-ориентированного подхода к гигиенической оценке состояния микробиома полости рта проведены подбор in silico и теоретическое обоснование расширенной панели генетических мишеней для ПЦР-диагностики. Разработанный набор праймеров и зондов к консервативным участкам гена 16S рРНК представителей «красного комплекса» P. gingivalis, T. denticola, T. forsythia и бактерии P. Intermedia как нормофлоры десневых карманов, ассоциированной со злокачественными новообразованиями слизистой оболочки полости рта, представляет собой инструмент для молекулярной диагностики, позволяющий проводить комплексную оценку микробиоты полости рта у здоровых людей и своевременно выявлять риски для здоровья. Наряду с консервативными участками гена 16S рРНК P. intermedia в качестве диагностического маркёра определён локус rgpA P. gingivalis. Использование гена rgpA, кодирующего аргинин-специфический гингипаин А, позволяет проводить углублённую донозологическую оценку патогенного потенциала микробиоты [30]. Поскольку RgpA оказывает прямое протеолитическое действие на коллаген I в тканях пародонта, это способствует разрушению соединительной ткани [31, 32], вызывает активацию провоспалительного каскада через рецепторы, активируемые протеазами (PARs) с выделением провоспалительных цитокинов (IL-6, IL-8, TNF-α), и нарушает иммунный ответ и апоптоз клеток, способствуя канцерогенезу [32–34]. Таким образом, включение праймеров к гену rgpA в панель мониторинга позволяет перейти от детекции бактерий к идентификации ключевой детерминанты их патогенности. Данный подход после валидации на клинических образцах обеспечит научно обоснованное прогнозирование рисков развития локальных воспалительных процессов и системных осложнений, формируя базу для персонализированных превентивных стратегий в гигиене и здравоохранении.

Заключение

Таким образом, нами осуществлён подбор in silico видоспецифичных праймеров и зондов для мультиплексной ПЦР в реальном времени с целью определения состава пародонтопатогенной микробиоты (P. gingivalis, T. denticola, T. forsythia, P. intermedia) у здоровых лиц. На данном этапе этот набор праймеров рассматривается как основа для будущей тест-системы, которая после обязательной клинической валидации (определения специфичности, чувствительности, испытаний на клинических образцах) сможет применяться для диагностики и контроля лечения таких состояний, как кариес, пародонтит, слизистые дисплазии, а также для гигиенической донозологической оценки риска развития рака слизистой оболочки полости рта. Риск-ориентированная парадигма подчёркивает, что диагностика должна быть настолько же избирательной, насколько многообразен микробиом полости рта. Разработка и клиническая валидация количественной ПЦР-панели является ключом к управлению рисками онкологической заболеваемости слизистой оболочки полости рта. Таким образом, принцип «больше риска – больше внимания» станет технологически реализуемым и экономически оправданным инструментом здравоохранения.