Метаболические и морфологические нарушения гепатобилиарной системы в динамике вибрационного воздействия

Введение

Многочисленными исследованиями установлено, что длительное вибрационное воздействие неблагоприятно влияет на здоровье человека и других теплокровных организмов [1–5]. Вибрационная нагрузка вызывает изменение нейрогуморальной регуляции, функциональных показателей нервной системы, приводит к развитию тканевой гипоксии и повреждению клеток различных органов [6, 7]. В последние годы опубликованы работы, посвящённые изучению влияния вибрации на различные органы, однако исследования их биохимического статуса и морфологического состояния, особенно на ранних стадиях воздействия, немногочисленны и показывают противоречивые результаты [8–11].

Цель настоящего исследования – изучить особенности изменения морфофункционального состояния гепатобилиарной системы крыс в динамике интермиттирующего вибрационного воздействия.

Материалы и методы

Эксперименты выполнены на крысах-самцах линии Wistar (n = 59, масса тела 160–240 г), полученных из ЦКП «Виварий конвенциональных животных» ИЦиГ СО РАН. Исследование одобрено локальным этическим комитетом ФГБНУ «Научно-исследовательский институт комплексных проблем гигиены и профессиональных заболеваний» (протокол заседания № 4 от 18.11.2021 г., § 2). Животные содержались и выводились из эксперимента в соответствии с требованиями Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых в экспериментальных или в иных научных целях (ETS № 123, Страсбург, 18.03.1986), и Руководства по содержанию и использованию лабораторных животных (Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, 1996).

Крысы были разделены на две группы – контрольную и опытную. Группы формировали методом случайных чисел с использованием массы тела в качестве ведущего признака. На опытную группу крыс воздействовали вибрацией на основной частоте 16 Гц, по виброускорению 120 дБ. Вибрационное воздействие проводили в интермиттирующем режиме, состоящем из чередования восьми 20-минутных периодов вибрации и восьми 10-минутных перерывов в течение четырёх часов в сутки пять раз в неделю с общей продолжительностью эксперимента девять недель [12]. Уровень вибрации измеряли с помощью анализатора шума и вибрации «Ассистент БВЕК.438150-005РЭ» (Москва). Выбранные уровни вибрации соответствовали реальному вибрационному воздействию в условиях производства. Группу контроля составили интактные животные, которые не подвергались вибрационному воздействию и содержались в стандартных условиях вивария со свободным доступом к воде и пище.

Изучение морфофункционального состояния гепатобилиарной системы у крыс осуществляли с помощью комплекса биохимических и гистологических методов исследования. Все экспериментальные исследования проводили с учётом воспроизводимости. Обязательным условием было использование крыс одного возраста и массы, содержание их в одинаковых условиях, соблюдение стандартности методик, что позволило нам сопоставить результаты, полученные у животных опытной и контрольной групп.

Биохимические исследования. Забор крови у крыс осуществляли из хвостовой вены через 3; 6 и 9 нед эксперимента. Перечень лабораторных показателей подобран с учётом этиопатогенетической связи развития негативных эффектов с воздействием вибрации. Стандартными методами с помощью диагностических наборов фирмы «Вектор-Бест» (Россия) определяли биохимические показатели сыворотки крови: активность аспартатаминотрансферазы (АСТ), аланинаминотрансферазы (АЛТ), щелочной фосфатазы, лактатдегидрогеназы (ЛДГ), креатинфосфокиназы (КФК), холинэстеразы и гамма-глутамилтрансферазы (γ-ГТ).

Гистологические исследования. Структурные изменения, развивающиеся в результате длительного вибрационного воздействия, оценивали по результатам морфологического исследования ткани печени крыс. Кусочки печени фиксировали 12%-м нейтральным формалином. После фиксации кусочки гистологического материала тщательно промывали, подвергали химической обработке с применением аппарата для гистологической проводки. Из полученного материала на санном микротоме делали срезы толщиной 3–7 мкм, которые окрашивали гематоксилином и эозином [13, 14]. Микроскопирование и динамическую микрофотосъёмку гистологических препаратов проводили с помощью микроскопа Olympus СX31 RBSF (Германия) при увеличении окуляра 10 × 18 и объектива 40× с водной и масляной иммерсией c использованием цифровой камеры Levenhuk C800.

Статистический анализ результатов эксперимента выполняли с помощью программы Statistica Base for Windows v.10 Russian. Для всех экспериментальных групп проверяли гипотезу на нормальность распределения по критерию Шапиро – Уилка. Для сравнения несвязанных групп при нормальном распределении признаков применяли t-критерий Стьюдента. Различия считали статистически значимыми при вероятности ошибки p < 0,05.

Результаты

Печени принадлежит ведущая роль в поддержании гомеостаза организма, особенно в условиях хронического воздействия факторов разной природы. Барьерные функции она осуществляет посредством механизмов, безусловно относящихся к компенсаторно-приспособительным, изучение которых актуально не только с позиции углубления теоретических представлений, но и практического применения в профилактике и коррекции печёночных нарушений.

Аланинтрансаминаза (АЛТ) и аспартаттрансаминаза (АСТ) – ферменты, катализирующие реакции трансаминирования, в клинической практике используются в качестве индикаторов патологических изменений печени. При интермиттирующем вибрационном воздействии на крыс в течение 9 нед в разные сроки обследования наблюдали рассогласованные достоверные изменения активности АЛТ и АСТ в сыворотке крови: на 30% повышенная активность АСТ к 6-й неделе выравнивалась с контролем к окончанию эксперимента. В то же время активность АЛТ, достоверно повышенная на 20% уже на 3-й неделе эксперимента, снижалась до нормальных значений на 6-й неделе и вновь росла на 50% к 9-й неделе (см. таблицу).

При субхроническом интермиттирующем вибрационном воздействии у крыс опытной группы было выявлено достоверное снижение активности щелочной фосфатазы в сыворотке на 30% к концу 9-й недели воздействия. Изменения в биохимическом статусе сыворотки крови показали достоверно значимые однотипные изменения активности лактатдегидрогеназы и креатинфосфокиназы: снижение активности к 3-й неделе, резкое повышение к 6-й неделе с плавным снижением к концу эксперимента. Значимые изменения активности к 6-й неделе также были отмечены у холинэстеразы и гамма-глутамилтрансферазы.

Результаты гистологических исследований показали, что при вибрационном воздействии в течение трёх недель печень сохраняла балочное и дольковое строение (см. рисунок на вклейке). Общая архитектоника органа не имела нарушений, гепатоциты были полигональной формы, приблизительно одинакового размера, с чёткими границами, однако в некоторых участках их контуры становились менее чёткими, что свидетельствовало о начальной стадии дистрофии. Ядра клеток были расположены центрально, характеризовались как нормохромные с равномерной структурой хроматина, что указывало на сохранение функциональной активности клеток. Синусоиды были умеренно расширены, в просветах наблюдались единичные клетки Купфера, количество которых незначительно превышало физиологическую норму. Эти клетки демонстрировали морфологические признаки минимальной активации. Портальные тракты сохраняли узкую структуру, в них выявлялись мелкие сосуды, внутрипечёночные желчевыводящие пути с сохранённым эпителием. Признаки воспаления или фиброзных изменений в портальных трактах отсутствовали. Сосуды триады имели несколько утолщённые стенки, начальные признаки гипертрофии или пролиферативных изменений. Центральные вены были неравномерно полнокровными, несколько расширенными, что могло отражать влияние вибрации на микроциркуляцию. В междольковых областях сосуды и синусоиды сохраняли структурную целостность. Капсула печени – тонкая, без признаков фиброза или воспалительной инфильтрации. Наблюдалась умеренная гипертрофия гепатоцитов. Некоторые клетки печени увеличивались в размерах, что может быть реакцией на продолжительное воздействие механического стресса и необходимость улучшения синтетической функции в ответ на повреждения.

После шести недель воздействия вибрации гепатоциты продолжали увеличиваться в размерах, гипертрофия становилась более выраженной, что свидетельствовало о продолжающейся реакции клеток на длительный стресс. Гиперплазия (увеличение числа клеток) становилась более заметной в местах с наиболее выраженными дистрофическими процессами. В гепатоцитах наблюдались более явные признаки дистрофии. В цитоплазме можно было выявить выраженную вакуолизацию, что указывало на более глубокие нарушения в метаболизме клетки. В некоторых клетках проявлялись признаки жировой дистрофии, особенно в области периально-центральных и портальных зон. Ядра гепатоцитов сохраняли гиперхромию, особенно в участках с наиболее выраженными дистрофическими процессами. В отдельных участках печени можно было увидеть признаки апоптоза, такие как фрагментация ядер и образование телец. Это свидетельствовало о клеточной гибели в ответ на длительное воздействие вибрации и развитие некротических процессов в тканях.

В сосудистой сети печени на 6-й неделе изменения также становились более выраженными. В некоторых участках, особенно в портальных трактах, наблюдалось заметное расширение сосудов. Это связано с нарушением микроциркуляции и увеличением проницаемости сосудов. Повышенная проницаемость сосудов могла способствовать отёку ткани и увеличению межклеточного пространства. На 6-й неделе продолжало ухудшаться состояние межклеточного пространства в печени, отёк был более выраженным, чем на 3-й неделе, и являлся следствием повышения проницаемости сосудов и увеличения количества жидкости в тканях.

В некоторых участках печени можно было наблюдать начало фиброзных изменений, что свидетельствовало о начале процесса замещения нормальной печёночной ткани соединительной. На 6-й неделе воздействия вибрации в некоторых областях печени можно было увидеть увеличенное количество воспалительных клеток, в том числе лимфоцитов, макрофагов и плазматических клеток. Эти признаки свидетельствовали о реакции печени на длительное воздействие стресса и повреждения, приводящие к начальной фазе воспаления.

Отмечены изменения в желчевыводящих путях: в некоторых местах печени можно было наблюдать небольшие расширения внутрипечёночных желчевыводящих путей вследствие нарушения нормального оттока желчи и застойных процессов. Эти нарушения могли произойти из-за повышения внутрипечёночного давления, вызванного нарушениями в микроциркуляции.

На девятой неделе наблюдали более выраженную гипертрофию гепатоцитов и признаки гиперхромии в их ядрах. Гепатоциты сохраняли полигональную форму, но появлялись более выраженные признаки дегенерации – вакуолизация и потеря чёткости клеточной структуры. В некоторых участках печени присутствовали признаки жировой и белковой дистрофии гепатоцитов. В сосудистом русле печени прогрессировали изменения, характерные для гипертрофии стенок венул и артериол. Утолщение стенок сосудов становилось более выраженным. В области портальных трактов появлялась лимфоплазмоцитарная инфильтрация, что может указывать на развитие хронического воспаления, обусловленного длительным воздействием вибрации.

Обсуждение

Известно, что воздействие вредных факторов производственной среды (вибрация, пыль, шум, тяжесть трудового процесса, охлаждающий микроклимат) является условием развития профессиональных патологий. В условиях хронического воздействия повреждающих факторов печень занимает ключевые позиции в поддержании гомеостаза организма. Барьерные функции она выполняет посредством механизмов, безусловно относящихся к компенсаторно-приспособительным, изучение которых актуально не только с позиции углубления теоретических представлений, но и практического применения в профилактике и коррекции печёночных нарушений [15, 16]. Многочисленные исследования показывают, что хроническое воздействие разнообразных производственных факторов приводит к развитию однотипных биохимических и морфологических изменений в печени и её сосудах – от преобладания начальных компенсаторно-приспособительных до выраженных дегенеративных [17, 18].

Аланинтрансаминаза и аспартаттрансаминаза, ферменты, катализирующие реакции трансаминирования, в клинической практике используются как индикаторы патологических изменений печени. Активность АЛТ и АСТ отражает преимущественно проницаемость мембран гепатоцитов, а не функциональное состояние органа [19, 20]. При интермиттирующем вибрационном воздействии на крыс в течение 9 нед в разные сроки обследования наблюдались рассогласованные достоверные изменения активности АЛТ и АСТ в сыворотке крови: повышенная активность АСТ к 6-й неделе выравнивалась с контролем к окончанию эксперимента, в то время как активность АЛТ, достоверно увеличенная уже на 3-й неделе эксперимента, снижалась до нормальных значений на 6-й неделе и вновь повышалась к 9-й неделе. Важно, что именно уровень АЛТ достоверно увеличивался, поскольку его активность является высокоспецифичным показателем для печени в отличие от АСТ и свидетельствует о начале необратимых мембранных нарушений гепатоцитов.

Одним из распространённых тестов, позволяющих выявить холестатическое действие веществ, является определение активности щелочной фосфатазы в плазме крови [21]. Однако этот тест не является специфичным индикатором токсического поражения печени, поскольку щелочная фосфатаза имеет мембранную локализацию, является полиорганным неспецифическим ферментом с внеклеточной активностью и отражает не только реакцию поражённого органа, но и всего организма. Снижение активности щелочной фосфатазы при вибрационном воздействии, выявленное к 9-й неделе эксперимента, более свидетельствовало об истощении функционально-метаболического резерва и развитии дезадаптации организма на клеточном уровне, нежели характеризовало состояние гепатобилиарной системы.

Активность лактатдегидрогеназы в крови относится к неспецифическим биохимическим показателям, отражающим повреждение тканей организма, поскольку ЛДГ является внутриклеточным ферментом, который локализуется в цитоплазме клеток и катализирует процессы превращения лактата (молочной кислоты) в пируват [22]. В норме содержание ЛДГ в крови незначительно, но при разрушении клеток, повышении проницаемости их мембран или повреждении тканей концентрация фермента резко возрастает [23]. В нашем исследовании выявлены достоверно значимые волнообразные изменения активности лактатдегидрогеназы: пониженные значения на 3-й неделе с резким повышением к 6-й неделе и плавным снижением к концу эксперимента. О нарушении функционального состояния ретикулоэндотелия печени свидетельствовало снижение активности γ-ГТ и щелочной фосфатазы в сыворотке крови [24]. В некоторых исследованиях отмечено, что низкие уровни γ-ГТ связаны с тяжестью поражения печени и неблагоприятным исходом, например, при атрезии желчевыводящих путей [25].

Холинэстераза – фермент, который преимущественно синтезируется в печени. Обычно при патологиях печени наблюдается снижение её активности, связанное с нарушением белково-синтетической функции гепатоцитов [26]. Повышение активности холинэстеразы к 6-й неделе эксперимента свидетельствовало о сохранной или даже усиленной синтетической функции, часто наблюдаемой при ожирении печени, а снижение к 9-й неделе указывало на нарушение функциональной способности гепатоцитов.

Результаты биохимических исследований подтверждались патоморфологическими изменениями в печени, развившимися у крыс в динамике интермиттирующего вибрационного воздействия. Через три недели воздействия вибрации на печень были выявлены начальные изменения – умеренные дистрофические процессы и некоторые адаптивные реакции. Они затрагивали как клетки печени (гепатоциты), так и сосудистую систему. В отдельных гепатоцитах можно было обнаружить слабовыраженную вакуолизацию цитоплазмы, что может указывать на начальную стадию белковой и жировой дистрофии. Ядра гепатоцитов оставались в основном нормохромными, однако в некоторых клетках отмечалась гиперхромия как признак увеличенной активности клеток в ответ на воздействие вибрации. На 3-й неделе воздействия вибрации в печени не отмечали признаков фиброза или хронического воспаления. В ткани отсутствовали значительные инфильтраты, а пролиферация фибробластов и образование соединительной ткани оставались минимальными. В некоторых участках печени могли встречаться единичные воспалительные клетки (лимфоциты), но в целом воспаление не было выражено. Морфологические изменения не были значительными, что позволяет предположить компенсаторный характер реакций печени на воздействие вибрации. Эти данные свидетельствуют о сохранении структурной и функциональной целостности печени без выраженных патологических изменений в условиях вибрационного воздействия средней интенсивности в течение трех недель.

Через шесть недель воздействия вибрации на печень в тканях продолжались дистрофические и сосудистые изменения, более выраженные, чем на 3-й неделе. Признаки адаптации организма к вибрационному стрессу усиливались, в печени начинали развиваться сложные реакции, связанные с нарушением функции и структурной целостности ткани.

На 9-й неделе наблюдалась более выраженная гипертрофия гепатоцитов, появлялись признаки дегенерации – вакуолизация и потеря чёткости клеточной структуры. В некоторых участках печени отмечались признаки жировой и белковой дистрофии гепатоцитов. Это может указывать на нарушение обмена веществ в печени, вызванное длительным воздействием вибрации. В области портальных трактов появлялась лимфоплазмоцитарная инфильтрация как возможный признак хронического воспаления, обусловленного длительным воздействием вибрации.

Сравнение результатов гистологических изменений на 3-й, 6-й и 9-й неделях воздействия вибрации на печень показало прогрессирующие морфологические структурные изменения в тканях, свидетельствующие о нарастающем повреждении, нарушении микроциркуляции, воспалении и дистрофии клеток. На 3-й неделе изменения начинали проявляться, на 6-й и 9-й неделях они становились более выраженными и достигали уровня, соответствующего хроническому повреждению тканей, которое может привести к значительным и, вероятнее всего, необратимым структурным нарушениям в дальнейшем.

Ограничения исследования. Опыты in vivo ограничивают их количество директивными документами по охране экспериментальных животных, направленными на сокращение протоколов исследований и минимизацию количества подопытных животных без снижения достоверности результатов.

Заключение

Полученные результаты позволяют выделить в динамике интермиттирующего вибрационного воздействия на гепатобилиарную систему три стадии: первая – к 3-й неделе эксперимента в печени запускаются адаптивные механизмы в виде повышения функциональной активности клеток; вторая стадия – декомпенсация, переходный период от физиологического ответа организма к патологическим нарушениям (6-я неделя эксперимента); третья стадия – истощение (9-я неделя). Таким образом, воздействие вибрации приводит к раннему срыву компенсаторных механизмов печени и развитию дистрофических изменений паренхимы с формированием очагов воспаления.