Ассоциации полиморфных генов – медиаторов воспаления IL-6 (rs1800795) и ТNF (rs1800629) с уровнем цитокинов у пациентов с вибрационной болезнью

Введение

Профессиональная деятельность работников горнодобывающей, авиа- и машиностроительной, транспортной и некоторых других отраслей промышленности связана с воздействием вибрации, шума и высоких нервно-психических нагрузок. Вибрация является сильным стрессирующим фактором и приводит к формированию вибрационной болезни (ВБ) [1]. В результате многолетних исследований установлено, что последствия влияния данных факторов способствуют возникновению функциональных нарушений иммунной и центральной нервной систем (ЦНС) у пациентов с ВБ [2, 3]. ЦНС представляет собой динамичную структуру, осуществляющую активное нейроиммунное взаимодействие в физиологических и патологических состояниях организма. В исследованиях влияния стрессовых факторов подчёркивается важная роль цитокиновой системы и нарушения баланса в ней [4]. Цитокины выступают основными медиаторами и участниками воспалительного ответа, что обусловливает их ведущую роль в патогенезе многих болезней [5]. При стрессе в тканях головного мозга повышается образование провоспалительных цитокинов и фактора некроза опухоли α (TNF-α), которые на молекулярном уровне участвуют в сложных когнитивных процессах, таких как синоптическая пластичность, нейрогенез, нейромодуляция. В ответ на стресс активируются и противовоспалительные цитокины (IL-4, IL-10 и др.) [6].

Сывороточная продукция цитокинов, вовлечённых в патогенез стресса, может быть опосредована функциональным полиморфизмом их генов. Установлено, что гены TNF-α и интерлейкинов 1, 6, 8, 10 (IL-1, IL-6, IL-8, IL-10) имеют отношение как к иммунной активации, так и к депрессии [7, 8]. В промоторной области гена IL-6 в положении –174 находится полиморфизм rs1800795. Этот полиморфный вариант оказывает влияние на транскрипцию и секрецию IL-6, и данные изменения рассматриваются как важные факторы риска развития болезней у человека [9]. Полиморфизм rs1800795 выступает полезным прогностическим маркёром при таких патологиях, как ишемическая болезнь сердца, воспалительные процессы, ишемический инсульт, ревматоидный артрит и хроническая воспалительная демиелинизирующая полинейропатия [10, 11].

Наряду с геном IL-6 представляет интерес полиморфный вариант гена TNF, продукт которого стимулирует синтез IL-1, IL-6. Наиболее важной мутацией является замена гуанина на аденин в позиции 308 (rs1800629), которая влияет на уровень белка TNF-α [12]. В исследованиях полиморфизма гена TNF были установлены ассоциации с сердечно-сосудистыми, эндокринными патологиями [13, 14], развитием депрессивных расстройств [15].

В ранее выполненных исследованиях у лиц с ВБ была установлена гиперпродукция провоспалительных цитокинов IL-1β, IL-6 и IL-8 [16]. Можно предположить, что сывороточная продукция цитокинов IL-6, TNF-α, отражающая нарушения нейроиммунного взаимодействия, опосредована функциональным полиморфизмом генов и может оказывать негативное влияние на течение вибрационной болезни, утяжеляя клиническую картину. Поэтому целью исследования была оценка ассоциации полиморфных генов IL-6 (rs1800795) и ТNF (rs1800629) с концентрациями цитокинов (IL-6, TNF-α, IL-4) у пациентов с вибрационной болезнью.

Материалы и методы

Методом анкетирования осуществляли сбор данных об этнической принадлежности пациентов. Все вошедшие в исследование лица – русские, проживающие на территории Иркутской области. На проведение исследования было получено разрешение локального этического комитета. После подписания информированного согласия в клинических условиях были обследованы 149 пациентов мужского пола с ВБ, возраст 50,5 (44–56) года, стаж работы в условиях воздействия вибрации – 22 (18,5–31) года (группа 1). Критерием включения было наличие установленного во время работы в контакте с вредным производственным фактором диагноза ВБ, отсутствие экспозиции вибрацией на момент исследования, черепно-мозговых травм в анамнезе, коморбидной патологии, которая могла бы повлиять на обмен цитокинов (ожирение, сахарный диабет, артериальная гипертензия). Все обследования выполнены при поступлении в клинику до лечения.

Группа сравнения (группа 2), сопоставимая по возрасту [55 (45–60) лет; р = 0,07], была представлена 40 здоровыми мужчинами, которые по специфике профессиональной деятельности не подвергались воздействию вибрации, не предъявляли жалоб на ухудшение памяти и внимания, не имели черепно-мозговых травм в анамнезе, а на момент исследования – острых и хронических (в стадии обострения) болезней.

Забор венозной крови проводили в вакутейнеры с К3ЭДТА (Improve, Китай), центрифугировали их при 3000 об./мин в течение 15 мин. Лейкоцитарную фракцию цельной крови аликвотировали и хранили в низкотемпературном холодильнике при температуре минус 70 °С (Sanyo, Япония). На следующем этапе выделяли ДНК с помощью наборов «ДНК-Экстран-1» («Синтол», Россия, кат. ном. Ex-509-100). Генотипирование выполняли с использованием коммерческих тест-систем для полиморфизмов G308A гена TNF (rs1800629), C174G гена IL-6 (rs1800795) фирмы «Синтол» (Россия, кат. ном. NP-465-100, NP-512-100) в режиме реального времени на приборе CFX-96 (BioRad, США) в соответствии с инструкцией от производителя.

Для определения концентраций IL-4, IL-6, ТNF-α у пациентов брали однократно натощак венозную кровь при поступлении в стационар, используя вакутейнеры с активатором свёртывания (Improve, Китай). Затем проводили центрифугирование при 1500 об./мин в течение 15 мин для получения сыворотки. Сыворотку отбирали в отдельные пробирки Эппендорф (Eppendorf). Методом иммуноферментного анализа определяли содержание IL-4, IL-6, ТNF-α с использованием наборов производства ЗАО «Вектор-Бест» (Новосибирск).

Статистическую обработку результатов проводили с помощью пакета прикладных программ Statistica 10.0. Наблюдаемую частоту генотипов проверяли на соответствие равновесию Харди – Вайнберга с применением онлайн-калькулятора (https://calcgeek.com/equilibriumhardy-weinberg/). Для оценки различий между группами по частотам аллелей и генотипов рассчитывали критерий (хи-квадрат с поправкой Йетса (χ²) и отношение шансов в онлайн-калькуляторах (https://medstatistic.ru/calculators/calchi.html, https://medstatistic.ru/calculators/calcodds.html соответственно). В случае отсутствия правильного распределения для оценки значимости различий между абсолютными количественными показателями использовали непараметрический метод – U-критерий Манна – Уитни. Различия считали статистически достоверными при уровне значимости р < 0,05, для трёх групп – р ≤ 0,017. Результаты исследований представлены в виде значения медианы (Me), интерквартильного размаха значений Q₁–Q₃.

Исследования выполнены с информированного согласия пациентов и одобрены Локальным этическим комитетом ФГБНУ ВСИМЭИ (заключение № 5 от 21.03.2023 г.).

Результаты

Распределение частот генотипов полиморфизма rs1800629 гена TNF у пациентов с ВБ и в группе сравнения соответствовало равновесию Харди – Вайнберга (χ² = 1,48; p = 0,224 и χ² = 1,02; p = 0,313 соответственно). В отличие от наблюдаемого распределения частот генотипов полиморфизма rs1800795 гена IL-6 у пациентов с ВБ, которое не соответствовало равновесию Харди – Вайнберга (χ² = 4,89; p = 0,027), в группе сравнения соблюдалось данное равновесие: χ² = 2,93; p = 0,087. Отклонение от равновесия Харди – Вайнберга в группе пациентов с ВБ может быть связано с небольшим размером выборки, однако в некоторых генетических исследованиях на аналогичных выборках пациентов с ВБ были получены результаты [17]. Не исключено, что это может быть связано с когортой обследуемых и влиянием таких этиологических факторов развития данной профпатологии, как воздействие вибрации и высоких нервно-психических нагрузок. Важно учитывать, что равновесие Харди – Вайнберга – это вероятностная модель, которая в реальных популяциях редко полностью соблюдается, поскольку их численность ограничена, генофонд имеет мутационную изменчивость, нет абсолютной изоляции от притока мигрантов, действуют дрейф генов и естественный отбор [18]. Для более ясного понимания необходимы дальнейшие исследования на более обширной выборке пациентов.

Результаты молекулярно-генетических исследований представлены в табл. 1. Наиболее значимые различия выявлены по частоте носительства гетерозиготного C/G генотипа гена IL-6 (rs1800795) у пациентов с ВБ. Это проявлялось в повышенной частоте носительства генотипа C/G у пациентов с профпатологией (p = 0,046) в отличие от лиц группы сравнения (54,4 и 35% соответственно). Статистический анализ отношения шансов показал, что у пациентов с ВБ и этим генотипом вероятность риска развития и усиления воспалительной реакции достоверно выше (OR = 2,212; 95% CI = 1,071–4,569) по сравнению с пациентами с гомозиготными генотипами G/G и C/C. Также установлена повышенная частота встречаемости редкого генотипа C/C в группе сравнения относительно пациентов с ВБ – 22,5 и 8,7% соответственно (p = 0,033). При этом генотипе значение отношения шансов и доверительного интервала было меньше 1, что говорит о вероятности снижения риска развития и усиления воспалительной реакции у данных лиц.

Исследование полиморфного локуса гена TNF (rs1800629) в сравниваемых группах не выявило различий в распределении его аллелей и генотипов. Необходимо отметить, что проведённое исследование не определило носителей редкой А/А гомозиготы rs1800629 в обеих группах (см. табл. 1).

Далее мы проанализировали изменения концентрации цитокинов IL-6, IL-4 и ТNF-α в зависимости от генотипов гена IL-6 (rs1800795) C174G. При разделении лиц обеих групп на подгруппы в зависимости от генотипов полиморфного варианта гена IL-6 (rs1800795) C174G и сопоставлении сывороточных концентраций IL-6 между ними не были установлены статистически значимые различия. При всех генотипах средний уровень IL-6 у пациентов с ВБ находился в пределах одних числовых значений (табл. 2). При наличии редкого генотипа C/C гена IL-6 (rs1800795) была выявлена тенденция к повышению уровня IL-4 в группе пациентов с ВБ (4,776 (3,822–5,881) пг/мл) при сопоставлении с группой сравнения (2,798 (2,71–4,286) пг/мл), р = 0,056. Стоит отметить, что уровень IL-4 у пациентов с ВБ при генотипах G/G и C/G был статистически значимо ниже (p = 0,011 и p = 0,017), чем при генотипе C/C. Анализ концентрации ТNF-α показал, что его уровень при генотипе G/G гена IL-6 (rs1800795) был понижен в группе пациентов с ВБ – 1,51 (0,415–3,675) пг/мл, в отличие от такового в группе сравнения – 2,689 (2,37–3,394) пг/мл (р = 0,028).

Средние значения сывороточного уровня ТNF-α и IL-4, IL-6 у пациентов с ВБ и в группе сравнения в зависимости от генотипов гена TNF (rs1800629) G308A представлены в табл. 3. Следует отметить, что статистически значимые различия в сравниваемых группах выявлены только в содержании ТNF-α. Уровень данного аналита при наличии генотипов G/G и G/A гена TNF (rs1800629) был понижен в группе пациентов с ВБ при сопоставлении с группой сравнения (р = 0,043 и р = 0,013 соответственно); был равен у пациентов с ВБ 1,544 (0,341–3,184) и 0,659 (0,336–2,253) пг/мл и лиц группы сравнения – 2,847 (2,3–3,394) и 2,745 (2,361–3,237) пг/мл соответственно. Также в группе с ВБ было отмечено статистически значимое повышение уровня IL-6 у лиц с генотипом G/A по сравнению с лицами с генотипом G/G (р = 0,048).

Обсуждение

В настоящее время известно, что механизмы развития воспалительных процессов могут быть ассоциированы с генетическим полиморфизмом цитокинов, хемокинов и их рецепторов. Однако опубликованные данные, касающиеся различных патологий и популяционных групп, зачастую противоречивы. Как известно, гиперпродукция провоспалительных цитокинов и процессы воспаления характерны и для развития ВБ.

По результатам проведённого нами исследования частота носительства гетерозиготного C/G генотипа гена IL-6 (rs1800795) была статистически значимо выше у пациентов с ВБ в отличие от лиц группы сравнения (см. табл. 1). В эксперименте in vivo Bennermo M. и соавт. было показано, что аллель G гена IL-6 (rs1800795) связан с усилением воспалительной реакции, проявляющейся повышением уровня IL-6 [19]. В одном из исследований было показано, что частота аллели ‒174G гена IL-6 в выборке этнических русских соответствует его частоте в популяциях Европы, где преобладает носительство аллельного варианта ‒174С гена IL-6, который отвечает за сниженную выработку провоспалительного цитокина [20, 21]. В нашем исследовании с этими данными согласуется повышенная частота встречаемости генотипа C/C в группе сравнения относительно пациентов с ВБ (см. табл. 1). Предполагают, что в связи с нарастанием антропогенного загрязнения окружающей среды, провоцирующего воспалительные реакции, риск ассоциированных с воспалением болезней будет увеличиваться в этнических группах с повышенными частотами аллели ‒174G гена IL-6 [20]. Следовательно, установленное статистически значимое носительство полиморфного локуса C/G гена IL-6 (rs1800795) у пациентов с ВБ может быть связано с возможным повышением уровня IL-6 и увеличением риска развития и усиления воспалительной реакции на начальных этапах формирования ВБ.

В результате проведённых ранее исследований у пациентов с ВБ было показано статистически значимое повышение уровней провоспалительных цитокинов IL-1β, IL-6 и IL-8 [16]. В этом исследовании при всех генотипах гена IL-6 (rs1800795) между группами пациентов с ВБ и сравнения не было выявлено статистически значимых различий в сывороточном содержании IL-6 (см. табл. 2). Было установлено, что уровень ТNF-α при генотипе G/G гена IL-6 (rs1800795) был понижен в группе пациентов с ВБ в отличие от такового в группе сравнения (см. табл. 2). Это, возможно, связано с механизмами взаимодействий данных цитокинов между собой. Известно, что стимулировать синтез IL-6 путём активации внутриклеточного сигнального пути NF-κB может TNF-α, усиливая воспалительный ответ. Поскольку наличие генотипа G/G способствует повышению уровня IL-6, а нами было выявлено снижение концентрации TNF-α у пациентов с ВБ, можно предположить, что в данном случае происходит развитие дисбаланса в системе цитокинов у данных пациентов.

Известно, что синтез ТNF-α клетками мозга и Т-лимфоцитами через механизм обратной связи может ограничивать IL-4, тем самым играя протективную роль при воспалительных процессах. IL-4 способен ингибировать продукцию провоспалительных цитокинов как в нормальных мозговых тканях, так и при развитии нейровоспаления [22, 23]. При наличии редкого генотипа C/C гена IL-6 (rs1800795), который отвечает за сниженную выработку IL-6, у лиц с ВБ была выявлена тенденция к наличию более высокого уровня IL-4 при сопоставлении с группой сравнения (см. табл. 2). А уровень IL-4 у пациентов с ВБ при генотипах G/G и C/G гена IL-6 (rs1800795) был статистически значимо ниже, чем при генотипе C/C (см. табл. 2). Было показано, что снижение экспрессии IL-4 усугубляло когнитивные нарушения и усиливало воспалительные реакции. В то же время терапия, направленная на повышение уровня IL-4, потенциально ослабляла эти эффекты за счёт повышения экспрессии нейротрофического фактора мозга и синаптофизина, подавления активации микроглии и снижения продукции провоспалительных цитокинов [24].

С воспалением может быть связан полиморфизм гена TNF (rs1800629) G308A, который усиливает транскрипционную активность гена и может влиять на воспалительные процессы. В нашем исследовании полиморфного локуса гена TNF (rs1800629) в сравниваемых группах не выявлено различий в распределении его аллелей и генотипов. В литературе встречается достаточно много исследований данного полиморфизма, результаты которых достаточно противоречивы. Обнаружена связь rs1800629 гена TNF с повышением уровней TNF-α при ишемическом инсульте у азиатов и европеоидов [25]. Согласно результатам метаанализа L. Hu и соавт., аллель А полиморфизма rs1800629 гена TNF обладает протективным эффектом и снижает риск развития аневризмы сосудов головного мозга у европеоидов [26]. Однако в содержании ТNF-α нами отмечены статистически значимые различия. Носительство аллели А гена TNF (rs1800629) связано с более высоким уровнем ТNF-α, а аллели G – с уменьшением его продукции [12]. У пациентов с ВБ и генотипом G/G наблюдалась такая тенденция. Стоит отметить, что и у лиц с ВБ и генотипом G/A уровень данного цитокина был снижен относительно группы сравнения (см. табл. 3). При этом в группе с ВБ было отмечено статистически значимое повышение уровня IL-6 у лиц с генотипом G/A по сравнению с лицами с генотипом G/G (см. табл. 3). Можно предположить, что снижение синтеза ТNF-α, установленные ранее у данных пациентов изменения в соотношении провоспалительных и противовоспалительных медиаторов [2, 16] и длительное воздействие профессиональных стрессирующих факторов приводят к хронической активации иммунной системы и истощению её клеток (макрофагов, моноцитов), которые являются основными продуцентами TNF-α. Следовательно, данные механизмы цитокиновой регуляции нейроиммунного ответа могут способствовать снижению уровня ТNF-α и развитию дисбаланса в системе цитокинов у пациентов с ВБ.

Известно, что функционирование цитокинов представляет собой слаженный механизм, в котором постоянно происходит кооперация. В связи с этим влияние на одно из звеньев цитокиновой системы вызывает сдвиги в функционировании всего комплекса и приводит к развитию различных патологических состояний [27]. Поскольку краткосрочный стресс сопровождается усилением иммунных реакций и, следовательно, увеличением числа циркулирующих цитотоксических Т-лимфоцитов, а долгосрочный хронический стресс снижает их эффективность [28], можно предположить, что полученные результаты свидетельствуют о компенсаторных механизмах цитокиновой регуляции нейроиммунного ответа у пациентов с ВБ.

Таким образом, у пациентов с ВБ при всех генотипах генов IL-6 (rs1800795) и TNF (rs1800629) происходит развитие дисбаланса в системе цитокинов. Данные механизмы цитокиновой регуляции нейроиммунного ответа могут способствовать изменению продукции и активности нейромедиаторов у этих пациентов [16, 29], что может привести к нарушению функций нейронов головного мозга [30].

Заключение

В результате проведённых исследований получены новые данные о частоте генотипов и аллелей полиморфных генов IL-6 (rs1800795) и TNF (rs1800629) у пациентов с вибрационной болезнью и в группе сравнения. Значимых ассоциативных зависимостей полиморфных вариантов генов IL-6 (rs1800795) и ТNF (rs1800629) с концентрациями IL-6 и TNF-α у пациентов с вибрационной болезнью выявлено не было. Вместе с тем полученные результаты показали, во-первых, повышенную частоту носительства C/G генотипа у пациентов с ВБ в отличие от лиц группы сравнения и, во-вторых, наличие повышенной относительно пациентов с ВБ частоты встречаемости генотипа C/C в группе сравнения. Генотип C/G гена IL-6 (rs1800795) у пациентов с ВБ может свидетельствовать о возможном его влиянии на уровень IL-6 и риске развития и усилении воспалительной реакции при формировании ВБ у данных пациентов, в том числе о негативном влиянии на развитие и течение данной профпатологии, утяжелении её клинической картины.

Результаты исследования свидетельствуют о развитии дисбаланса в системе цитокинов и нарушениях нейроиммунного взаимодействия у пациентов с ВБ, что может быть обусловлено в совокупности как генетическими факторами, так и эпигенетическими изменениями. Полученные данные вносят вклад в изучение роли медиаторов воспаления в патофизиологических механизмах формирования и развития ВБ, разработку комплексных подходов предикции воздействия профессиональных стрессирующих факторов на основе генетических и эпигенетических представлений. Для более детальной оценки вклада генетического фактора в изменение концентраций медиаторов воспаления необходимы дальнейшие исследования на многочисленных выборках пациентов.