Обоснование перспективности использования культуры клеток HuTu 80 для выявления химического загрязнения воды источников хозяйственно-питьевого водопользования населения

Введение

Оценка качества и безопасности воды источников хозяйственно-питьевого водопользования населения (далее – водоисточников) в Российской Федерации включает проведение лабораторных исследований, в том числе для количественного определения химических веществ в соответствии с требованиями нормативно-методических документов (СанПиН 1.2.3685–21¹, МР 2.1.4.0176–20² и др.). Однако данный подход не в полной мере учитывает вероятность развития негативных эффектов, обусловленных сочетанным воздействием химических веществ и продуктов их трансформации, а также наличием химических веществ, не входящих в перечень контролируемых показателей (МР 2.1.4.0176–20²) [1]. В связи с этим потенциальные риски для здоровья населения, связанные с воздействием химического фактора среды обитания, могут быть значительно выше, что обусловливает необходимость дополнения существующего подхода к гигиенической оценке качества среды обитания человека новыми разработками. Одно из перспективных направлений решения данной задачи – использование альтернативных биологических моделей, в том числе клеточных тест-систем in vitro [2].

Для выявления химического загрязнения воды источников хозяйственно-питьевого водопользования населения целесообразным может стать дополнение традиционных химико-аналитических методов подходами, основанными на использовании биологических объектов, например, клеточных культур желудочно-кишечного тракта человека [2–4]. Культура клеток аденокарциномы двенадцатиперстной кишки человека HuTu 80 часто используется для изучения механизмов развития токсических эффектов, ассоциированных с воздействием химических соединений [5–7]. Клетки линии HuTu 80 имеют эпителиальную природу и представляют собой устойчивые патологические клоны клеток поверхности двенадцатиперстной кишки [5, 8, 9]. Клеточная линия HuTu 80 эффективна при оценке микробного загрязнения воды и потенциально может быть использована в дополнение к физико-химическим методам анализа при оценке её качества по санитарно-химическим показателям [10, 11].

Цель исследования – обоснование применения культуры клеток человека HuTu 80 для выявления химического загрязнения воды источников хозяйственно-питьевого водопользования населения по результатам экспериментального моделирования.

Материалы и методы

В рамках исследования использовали пробы воды источников хозяйственно-питьевого водопользования населения (n = 10), отобранные в 2024–2025 гг. в Саратовской, Астраханской областях и Республике Калмыкия. Отбор, транспортировку и хранение проб осуществляли согласно требованиям ГОСТ 31861–2012³. Санитарно-химические исследования проб воды проводили в лаборатории физико-химического анализа Саратовского МНЦ гигиены ФБУН «ФНЦ медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения» Роспотребнадзора с применением титриметрического, спектрофотометрического методов анализа и атомно-абсорбционной спектроскопии. Качество воды оценивали по расширенному перечню показателей (45 физико-химическим показателям), включая обязательный минимум (МР 2.1.4.0176–20²), в соответствии с нормативными значениями, установленными СанПиН 1.2.3685–21¹.

Для моделирования химического состава нативных проб воды применяли водные растворы солей с рассчитанными массовыми концентрациями хлорид-ионов (NaCl и CaCl₂), сульфат-ионов (Na₂SO₄), ионов магния (MgSO₄ ∙ 5H₂O), ионов лития (Li₂SO₄). В работе использовали реактивы квалификации ч.д.а. (АО «Вектон», Санкт-Петербург)». В качестве тест-объекта для оценки эффектов воздействия проб воды и модельных растворов использовали перевиваемую монослойную линию аденокарциномы двенадцатиперстной кишки человека HuTu 80 (источник получения культуры – центр коллективного пользования «Коллекция культур клеток позвоночных» Института цитологии РАН, Санкт-Петербург). Клетки линии HuTu 80 культивировали в полной среде DMEM (ПанЭко, Россия), содержащей 1% незаменимых аминокислот, 2 мM глутамина, 1 мM пирувата натрия, 1,5 г/л бикарбоната натрия, 4,5 г/л D-глюкозы, 10% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота (Capricorn, Германия) с добавлением пенициллина/стрептомицина (по 100 ед./мл, Capricorn, Германия). Режим культивирования: температура плюс 37 °C в атмосфере 5%-го CO₂ в культуральном флаконе (NEST Biotechnology Co., LTD., Wuxi, Китай), термостат (Binder GmbH, Германия). В экспериментах использовали клетки, прошедшие не более 10 пассажей [12].

Пробы воды объёмом 2 мл концентрировали путём инкубирования в течение 1,5 ч на водяной бане (LOIp, Россия) при температуре плюс 70 °C. Такой способ обработки позволил концентрировать образцы и одновременно инактивировать вегетативные формы микроорганизмов, что необходимо для работы с культурой клеток in vitro. Объём концентрированных проб составлял 25% от исходного (четырёхкратное концентрирование). После охлаждения анализируемой пробы до комнатной температуры её объём восстанавливали до исходного с использованием полной среды DMEM. Для оценки эффективности деконтаминации проб воды выполняли контрольный высев каждой исследуемой пробы на агаризованную питательную среду LB (Luria-Bertani) [13] в чашках Петри в двух повторностях и инкубировали в течение пяти дней в термостате при температуре плюс 37 °C.

Оценку эффектов воздействия проб воды на культуру клеток HuTu 80 проводили с использованием теста, основанного на ингибировании пролиферации клеток, измеренной по активности митохондриальных дегидрогеназ, восстанавливающих производные тетразолия (МТТ-тест). После достижения 70–90% конфлюентности интактные клетки снимали с культурального флакона с помощью раствора трипсин-ЭДТА (0,25% трипсина и 0,2% ЭДТА, Capricorn, Германия) и высевали в 96-луночные культуральные планшеты (NEST Biotechnology Co., LTD., Wuxi, Китай) с плотностью посева 1 ∙ 10⁴ клеток на лунку. Клетки инкубировали в планшетах до образования 70% монослоя в течение 48 ч, после чего среду удаляли и заполняли лунки пробами воды, подготовленными согласно приведённому выше способу (восемь лунок для анализа одной пробы воды). В качестве контрольных образцов лунки с клетками заполняли 200 мкл культуральной среды, содержащей 25% дистиллированной воды и 75% полной среды DMEM.

Модельные поллютанты растворяли в среде DMEM, стерилизовали фильтрованием через шприцевую фильтрующую насадку с диаметром пор 0,1 мкм и добавляли по 50 мкл в лунки, содержащие 150 мкл полной среды DMEM. Клетки со средой на основе подготовленных проб воды или растворов модельных поллютантов инкубировали в течение 48 ч при температуре плюс 37 °С в атмосфере 5%-го СО₂. По окончании инкубации среду удаляли и добавляли к клеткам 100 мкл раствора МТТ (3(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолий бромид, Sisco Research Laboratory pvt. Ltd., Индия) до концентрации 1 мг/мл и инкубировали в течение трёх часов в тех же условиях. Раствор МТТ удаляли, образовавшиеся в жизнеспособных клетках кристаллы формазана растворяли в 200 мкл 99%-го диметилсульфоксида (DMSO, Molekula Ltd., Великобритания) и инкубировали в течение 15 мин в тех же условиях.

Значение МТТ-теста как опытных, так и контрольных повторностей определяли как разницу средних значений оптической плотности элюата, измеренной при 530 и 620 нм с использованием планшетного анализатора (Пикон, Россия).

Жизнеспособность клеток рассчитывали по формуле (1):

жизнеспособность = (ОП_о / ОП_к) ∙ 100%,              (1)

где ОП_о – разница оптической плотности элюата опытной группы при длинах волн 530 и 620 нм; ОП_к – разница оптической плотности элюата контрольной группы при длинах волн 530 и 620 нм.

Эффекты воздействия проб воды на культуру клеток HuTu 80 оценивали по статистически значимому (p < 0,05) изменению их дыхательной активности после 48-часовой инкубации с исследуемой пробой воды по сравнению с контролем (дыхательная активность клеток после 48-часовой инкубации в полной среде принята за 100%).

Статистическую обработку данных выполняли с помощью пакета прикладных программ Statistica for Windows v. 7.0, StatSoft Inc и Microsoft Excel 2010. Оценивали средние значения и стандартные отклонения, использовали двусторонний t-критерий Стьюдента, а также однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA) с применением F-критерия Фишера и последующей процедурой множественных сравнений по Тьюки при уровне значимости p < 0,05. Определение эффективных концентраций ионов неорганических веществ (EC₂₀) и их 95%-х доверительных интервалов осуществляли при помощи пробит-анализа с использованием программного обеспечения EpA Benchmark Dose Software (BMDS, версия 3.3, U.S. Environmental protection Agency).

Результаты

Физико-химический анализ проб воды водоисточников выявил превышение нормативных показателей содержания химических веществ в пяти пробах. Диапазон превышений гигиенических нормативов по санитарно-химическим показателям в исследованных пробах составил от 1 до 2,7 ПДК. Параллельно с физико-химическим анализом оценивали эффекты воздействия проб воды на культуру клеток аденокарциномы двенадцатиперстной кишки человека HuTu 80. Результаты приведены в табл. 1.

Согласно результатам, представленным в табл. 1, шесть исследуемых проб воды оказывали влияние на метаболическую активность культуры клеток HuTu 80 в условиях 48-часовой экспозиции. Пробы воды № 1, 2 и 5 вызывали развитие цитотоксического эффекта, проявляющегося в статистически значимом снижении метаболической активности клеток на 57,9, 14,1 и 36,2% соответственно по сравнению с контролем (100%) при p < 0,05. Превышение гигиенических нормативов в указанных пробах воды составляло от 1,5 до 2,7 ПДК для хлоридов, от 1,8 до 2,3 ПДК для магния, от 1,2 до 1,5 ПДК для сульфатов, от 2,2 до 2,4 ПДК для натрия, 2 ПДК для лития.

Наличие превышений гигиенических нормативов по отдельным химическим веществам в пробах воды № 3 и 4 (до 1,4 ПДК по хлорид-ионам и ионам магния) не сопровождалось проявлением негативного эффекта. Вместе с тем пробы воды № 6, 7 и 8 вызывали статистически значимое изменение метаболической активности клеток по сравнению с контролем (p < 0,05), несмотря на отсутствие превышений гигиенических нормативов содержания химических веществ (см. табл. 1).

Для установления связи между содержанием химических веществ в концентрациях, превышающих гигиенические нормативы, и изменением метаболической активности культуры клеток при их воздействии состав исследуемых проб воды был воспроизведён в модельных экспериментах. В химический состав модельных растворов включали вещества, идентифицированные по результатам настоящего исследования как приоритетные загрязнители воды водоисточников (ионы лития, натрия, магния, а также хлорид- и сульфат-ионы) в концентрациях, соответствующих нативным пробам воды № 1, 2, 3, 4, 5. Результаты представлены в табл. 2.

Воздействие модельных растворов и соответствующих им нативных проб проявлялось в статистически значимом снижении метаболической активности клеток по сравнению с контролем (p < 0,01). Различия в процентном изменении жизнеспособности культуры клеток HuTu 80 при воздействии нативных проб воды № 2, 3, 4, 5 и соответствующих им модельных растворов были статистически незначимы (p > 0,05). При этом метаболическая активность клеток при воздействии нативной пробы № 1 и её модельного раствора статистически значимо различалась (разница эффектов воздействия составила 42,7%) (см. табл. 2).

Модельные растворы солей, ионный состав которых соответствовал пробам воды № 3 и № 4 (превышения до 1,4 ПДК), не вызывали статистически значимого снижения метаболической активности клеток (жизнеспособность 98,1 и 104,6% соответственно; p > 0,05) по сравнению с контролем, что согласуется с данными, полученными при оценке эффектов воздействия соответствующих нативных проб (p < 0,05) (см. табл. 2).

Для установления связи между концентрациями ионов магния, лития, натрия, а также хлорид- и сульфат-ионов в воде и их влиянием на метаболическую активность клеточной линии HuTu 80 определяли эффективные концентрации (EC₂₀) ионов (табл. 3).

Установлено, что расчётные значения EC₂₀ для ионов магния, натрия, хлорид- и сульфат-ионов превышают установленные гигиенические нормативы их содержания в воде (до 5,5 ПДК) (см. табл. 3). При этом отмечена высокая чувствительность культуры клеток HuTu 80 к ионам лития, проявляющаяся при концентрациях ниже предельно допустимых.

Для оценки совместного влияния химических веществ на метаболическую активность культуры клеток HuTu 80 определены эффекты воздействия отдельных соединений в концентрациях, соответствующих пробе № 1, характеризующейся наибольшим числом показателей, превышающих предельно допустимые значения. В ходе исследования были приготовлены растворы солей MgSO₄, Na₂SO₄, CaCl₂ и NaCl с содержанием ионов в концентрациях, соответствующих пробе № 1. Влияние растворов солей на метаболическую активность клеток было оценено в сравнении между собой, а также с модельным раствором и контролем (без токсикантов) (табл. 4).

Результаты однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) показали, что ионы, вносимые в составе солей модельного раствора № 1 (Mg²⁺, Ca²⁺, Na⁺, Cl⁻, SO₄²⁻), в различной степени влияли на метаболическую активность клеток по сравнению с контролем. Статистически значимое изменение метаболизма клеток наблюдалось при воздействии сульфат-содержащих солей MgSO₄ (p = 0,039) и Na₂SO₄ (p = 0,0291). При этом сочетанное воздействие компонентов модельной пробы № 1 вызывало наиболее выраженное снижение жизнеспособности культуры (p = 0,0001).

Обсуждение

Наличие в воде источников хозяйственно-питьевого водопользования химических веществ в концентрациях, превышающих нормативные величины, является потенциальной угрозой для здоровья населения и ухудшает гигиенические условия водопользования. В связи с этим возрастает интерес к разработке и применению методов, основанных на использовании биологических моделей в системе in vitro в качестве маркёров ухудшения качества воды по санитарно-химическим показателям [14, 15]. С целью определения перспективности применения культуры клеток двенадцатиперстной кишки человека HuTu 80 для выявления химического загрязнения проб воды источников хозяйственно-питьевого водопользования населения нами впервые было проведено исследование нативных проб воды, а также выполнено экспериментальное моделирование воздействия выявленных поллютантов (ионов магния, натрия, лития, хлорид- и сульфат-ионов).

Сопоставление результатов оценки эффектов воздействия нативных проб воды на культуру клеток HuTu 80 с их химическим составом позволило установить связь изменения метаболической активности клеток c содержанием в пробах некоторых ионов. Так, снижение метаболической активности клеток проявлялось в ответ на воздействие проб воды, в которых зафиксировано превышение гигиенических нормативов содержания хлоридов (до 2,7 ПДК), магния (до 2,3 ПДК), сульфатов (до 1,5 ПДК), натрия (до 2,4 ПДК) и лития (до 2 ПДК). Полученные результаты подтверждаются данными экспериментального моделирования воздействия растворов солей (соответствующих по составу нативным пробам), согласно которым изменения метаболической активности культуры клеток в нативных пробах и модельных вариантах не имели достоверных различий (p > 0,05).

Важно отметить, что наличие превышений нормативных значений до 1,4 ПДК по содержанию ионов магния и хлорид-ионов не приводило к изменению метаболической активности на клеточном уровне, что согласуется с тем, что данные химические вещества являются малотоксичными. Негативное воздействие ионов магния, натрия, лития, хлоридов и сульфатов в тех пробах, где оно было зафиксировано, вероятнее всего, определяется осмотическим стрессом, нарушением ионного гомеостаза и фрагментацией ДНК [16–19].

Проба воды водоисточника представляет собой сложный многокомпонентный раствор, в котором химические вещества присутствуют в различных концентрациях и сочетаниях. Согласно результатам моделирования сочетанного воздействия приоритетных загрязнителей воды водоисточников на культуру клеток HuTu 80, установлено, что эффект смеси веществ (модельной пробы) был статистически значимо выше по сравнению с их влиянием по отдельности. Наиболее выраженное изменение метаболической активности зафиксировано при воздействии на культуру клеток нативной пробы воды №1 (жизнеспособность клеток 42%) по сравнению с модельным раствором (жизнеспособность клеток 84,8%), что обусловлено комбинированным действием всех содержащихся в пробе воды химических веществ, а также, вероятно, присутствием загрязнителей, не вошедших в перечень оцениваемых в ходе химико-аналитического исследования.

Для определения чувствительности культуры клеток к содержанию в воде приоритетных загрязнителей проведена оценка их эффективных концентраций. Показано, что чувствительность культуры клеток к ионам натрия, магния, сульфат- и хлорид-ионам на уровне 20%-го изменения метаболической активности соответствует концентрациям веществ от 2 до 5,5 ПДК. Чувствительность к ионам лития проявлялась при концентрациях ниже предельно допустимой, что демонстрирует потенциал применения культуры клеток линии HuTu 80 для мониторинговых исследований и выявления химического загрязнения воды водоисточников данными веществами.

Процесс идентификации загрязняющих веществ, не входящих в обязательный перечень показателей, контролируемых в воде водоисточников в рамках надзорных мероприятий, требует проведения расширенных лабораторных исследований качества воды. Согласно МР 2.1.4.0176–20², комплексная оценка качества воды водоисточника с использованием расширенного перечня показателей должна проводиться не реже одного раза в пять лет. Однако в условиях  чрезвычайных ситуациях или при антропогенном загрязнении, сопровождающемся поступлением в водоисточник химических веществ, в том числе ранее не идентифицированных, культура клеток HuTu 80 потенциально может быть использована в качестве тест-объекта для оперативного выявления загрязнения воды химическими веществами.

Так, выявленное изменение метаболической активности клеток HuTu 80 при воздействии проб воды водоисточников, в которых не были зафиксированы превышения нормативных значений показателей, потенциально может свидетельствовать о наличии химических веществ, не вошедших в перечень контролируемых, и выступать в качестве основания для проведения расширенного химико-аналитического исследования водоисточника с целью идентификации конкретных соединений, чувствительность к которым культуры клеток известна по результатам лабораторных испытаний.

Отсутствие специфичной реакции культуры клеток человека к химическому составу воздействующей пробы воды и обоснованного механизма переноса результатов на организм человека определяет необходимость проведения дальнейших исследований для выявления патогенетических маркёров, характеризующих развитие общих токсических процессов в культуре клеток (в том числе аденокарциномы двенадцатиперстной кишки человека HuTu 80) и организме человека.

Заключение

Экспериментальное моделирование воздействия отдельных химических веществ в концентрациях, превышающих предельно допустимые, показало, что последние могут оказывать влияние на метаболическую активность культуры клеток HuTu 80. Наибольшая чувствительность клеток HuTu 80, проявляющаяся при концентрациях, сопоставимых с установленными гигиеническими нормативами (0,7 ПДК), отмечена к ионам лития. Реакция клеток на воздействие отдельных приоритетных загрязнителей в воде водоисточников в большинстве случаев соотносилась с результатами моделирования химического состава нативных проб № 2, 3, 4, 5, исключение составила проба № 1. В последнем случае реакция культуры клеток могла быть обусловлена присутствием веществ, воздействие которых не учитывалось при моделировании химического состава (или не вошедших в перечень оцениваемых по результатам физико-химического анализа). Таким образом, результаты проведённого исследования нативных проб воды источников хозяйственно-питьевого водопользования населения и экспериментального моделирования их состава на основе впервые применённого нами подхода продемонстрировали перспективность использования культуры клеток HuTu 80 для выявления химического загрязнения.

¹ СанПиН 1.2.3685–21 «Гигиенические нормативы и требования к обеспечению безопасности и (или) безвредности для человека факторов среды обитания».

² MP 2.1.4.0176–20 «Организация мониторинга обеспечения населения качественной питьевой водой из систем централизованного водоснабжения».

³ ГОСТ 31861–2012 «Вода. Общие требования к отбору проб».