Исследование печени лабораторных крыс при хроническом ингаляционном воздействии наночастиц оксида свинца

Введение

Увеличение химической нагрузки на окружающую среду – серьёзная угроза для здоровья человека. Одним из распространённых поллютантов выступает свинец, который загрязняет воздух не только производственных помещений, но и атмосферу промышленных городов и мегаполисов [1, 2].

Наибольшую опасность для здоровья человека представляют ультрадисперсные частицы свинца, входящие в состав многокомпонентного аэрозоля [3–5]. Одним из органов-мишеней для наночастиц (НЧ) свинца выступает печень, что связано с её детоксикационной функцией. В научной литературе встречаются данные о токсическом действии НЧ свинца на печень [6, 7] при пероральном и ингаляционном воздействии, однако преимущественно оценивались острая и субхроническая токсичность. Хроническое же воздействие свинца на печень изучалось преимущественно на более крупных частицах [8] и в эпидемиологических исследованиях [9, 10], в то время как токсичность НЧ свинца на печень при длительном воздействии изучена недостаточно.

Таким образом, целью данного исследования стала оценка гепатотоксических эффектов наночастиц оксида свинца при хроническом ингаляционном воздействии в эксперименте in vivo на крысах.

Материал и методы

Эксперимент проводился на аутбредных крысах-самках массой тела 321,47 ± 3,85 г (разброс по массе не превышал 10%), которых случайным образом разделили на две группы по 10 крыс в каждой – «Контроль» и «НЧ PbO». Животных содержали в соответствии с требованиями ГОСТ 33216–2014¹. Исследование было одобрено локальным этическим комитетом ФБУН ЕМНЦ ПОЗРПП Роспотребнадзора (протокол № 4 от 12.06.2022 г.).

Экспозицию НЧ PbO в концентрации 0,2 мг/м³ выполняли с помощью ингаляционной установки по типу «только нос» (CH Technologies, СШA) в течение 4 час в день 5 раз в неделю на протяжении 4 мес. НЧ генерировали с помощью электрического искрения между свинцовыми стержнями 99,99%-й чистоты в атмосфере азота. Полученные НЧ смешивались с воздухом, окислялись до PbO и подавались воздушным потоком в ингаляционную установку. Для фиксации положения во время ингаляции животных помещали в рестрейнеры. Для определения размера НЧ отбирали на фильтр и анализировали с помощью сканирующей электронной микроскопии (СЭМ), средний диаметр – 18,2 ± 4,2 нм.

По окончании экспозиционного периода проводили забор крови из бедренной артерии под изофлурановым наркозом для последующего биохимического анализа. Затем животных выводили из эксперимента путём быстрой декапитации и проводили аутопсию. Сразу после извлечения печени оценивали её массовые показатели (абсолютная и относительная масса) с использованием весов неавтоматического действия BM-300G специального (I) класса точности.

Биохимические параметры сыворотки крови (альбумин, щелочная фосфатаза (ЩФ), аланинаминотрансфераза (АЛТ), аспартатаминотрансфераза (АСТ), билирубин общий, холинэстераза, C-реактивный белок (СРБ), гамма-глутамилтранспептидаза (ГГТП), лактатдегидрогеназа (ЛДГ), триглицериды, холестерин, липопротеины высокой плотности (ЛПВП), липопротеины низкой плотности (ЛПНП) определяли с помощью автоматического биохимического анализатора Cobas Integra 400 plus стандартными наборами согласно инструкции. Малоновый диальдегид лизата цельной крови определяли в кислой среде с тиобарбитуровой кислотой при длине волны 580 нм. Активность каталазы сыворотки крови определяли в пробах по образованию комплекса перекиси водорода с молибденовокислым аммонием при длине волны 410 нм на спектрофотометре СФ-2000. Определение активности пероксидазы проводили в цельной крови индигокарминовым методом при оптической плотности 590 нм. Определение восстановленного глутатиона (GSH) цельной крови выполняли спектрофотометрическим методом с использованием реактива Элмана, оптическую плотность измеряли при длине волны 305 нм.

Гистологическое исследование печени проводили по дистрофическим изменениям, количеству полиплоидных двуядерных гепатоцитов и инфильтрации портальной зоны. Ткани печени фиксировали, обезвоживали и парафинизировали, а затем подготавливали ультратонкие срезы. Полученные препараты окрашивали гематоксилином и эозином и исследовали с помощью светового микроскопа Axio Lab.A1 при увеличении ×750².

Оценку цитоморфологических показателей клеток (клетки эпителия протоков, гепатоциты, дегенеративно изменённые гепатоциты, нейтрофилы, эозинофилы, двуядерные клетки, купферовские макрофаги, фибробласты) мазков-отпечатков печени крыс оценивали при подсчёте на 200 клеток при увеличении ×100 с использованием светового микроскопа Axio Lab.A1 и в соответствии с принятыми критериями [11].

Дополнительной морфологической характеристикой, которая позволила оценить уровень метаболизма и выявить компенсаторные реакции, служило ядерно-цитоплазматическое отношение (ЯЦО) клеток печени, которое определяли по соотношению площадей ядер и клеток³.

Для исследований морфометрических показателей митохондриального профиля гепатоцитов было проанализировано соотношение пяти последовательных стадий изменения внутренней мембраны митохондрий в соответствии с классификацией M. Sun и соавт. [12] с помощью просвечивающего электронного микроскопа сверхвысокого разрешения Hitaсhi REGULUS SU8220 в режиме BF-STEM (увеличение ×25 000).

Оценку уровней экспрессии генов bax, bcl-2 в ткани печени осуществляли с применением молекулярно-генетических методов исследования [13]. Методика анализа экспрессии генов включала экстракцию тотальной РНК из тканей печени с помощью реагента ExtractRNA («Евроген», Россия) и последующий синтез кДНК с использованием набора MMLV-RH («Диаэм», Россия).

Все полученные данные были представлены в виде среднего значения ± стандартная ошибка среднего, если не указано иное. Нормальность распределения данных оценивали с использованием критерия Шапиро – Уилка, а статистическую значимость между групповыми значениями – с применением U-критерия Манна – Уитни и t-критерия Стьюдента при помощи программного обеспечения Statistica 10 (StatSoft, Inc., США). Значения считали статистически значимыми при p ≤ 0,05.

Результаты

Хроническое ингаляционное воздействие НЧ PbO привело к развитию у крыс комплекса биохимических и морфологических изменений, свидетельствующих о гепатотоксическом действии. При биохимическом исследовании крови в группе «НЧ PbO» зафиксировали статистически значимое увеличение уровня маркёра системного воспаления СРБ, а также повышение концентрации МДА и каталазы относительно контрольных значений. Были отмечены также тенденции к росту восстановленного глутатиона и пероксидазы (табл. 1).

Гистологическое исследование тканей печени экспонированных животных выявило дистрофические изменения, увеличение количества полиплоидных двуядерных гепатоцитов и выраженную лейкоцитарную инфильтрацию портальной зоны (рис. 1, а–в, см. на вклейке). При этом относительная масса печени (2,58 ± 0,09 г/100 г м.т. против 2,59 ± 0,12 г/100 г м.т. в контроле), а также отношение площади поперечного сечения гепатоцитов к их ядрам (в обеих группах ≈ 0,12 у. е.) значимо не отличались от контроля.

Анализ цитограмм мазков-отпечатков подтвердил наличие повреждения паренхимы органа: выявлено статистически значимое увеличение доли дегенеративно изменённых гепатоцитов и снижение количества клеток эпителия протоков (табл. 2).

СЭМ-анализ ультраструктуры клеток печени выявил все морфотипы митохондрий, описанных в работе Sun M. и соавт. [12] (рис. 2, a–д, см. на вклейке). В группе «НЧ PbO» было установлено изменение в распределении морфотипов: доля патологического везикулярно набухшего морфотипа увеличилась на 17,3% (p ≤ 0,05) с соответствующим снижением доли нормальных форм.

На молекулярном уровне это сопровождалось значимым увеличением экспрессии проапоптотического гена bax и тенденцией к росту соотношения bax/bcl-2 (рис. 3).

Обсуждение

Проведённое исследование выявляет сложный патогенез гепатотоксичности, индуцированной хроническим ингаляционным воздействием НЧ PbO.

Статистически значимое увеличение уровня МДА и СРБ указывает на индукцию НЧ PbO процессов перекисного окисления липидов и системного воспалительного ответа, что согласуется с общепризнанным механизмом токсичности НЧ [14–16]. Компенсаторный рост активности каталазы и пероксидазы, а также показателя восстановленного глутатиона подтверждают активацию антиоксидантной системы [17, 18]. Отсутствие значимых изменений оставшихся уровней билирубина, АЛТ, АСТ, ЩФ, концентрации общего белка, альбумина, липидного профиля и холинэстеразы не согласуется с экспериментальными данными о свинцовых НЧ, представленных в [6, 19, 20]. Подобные различия могут быть обусловлены условиями эксперимента, в том числе разными дозой, периодом экспозиции или методом введения.

Гепатотоксичность НЧ PbO при ингаляционном воздействии подтверждается полученными результатами анализа мазков-отпечатков и гистологического исследования, которые указывают на воспалительные и дистрофические изменения в печени. Такие патологические изменения могут быть связаны с окислительным стрессом, воспалением, митохондриальной дисфункцией и апоптозом [14, 19, 21].

Морфометрический анализ клеток печени показал, что ингаляционное поступление НЧ PbO в концентрации 0,2 мг/м³ в течение 4 мес не привело к статистически значимым изменениям отношения площади поперечного сечения ядер к цитоплазме гепатоцитов по сравнению с контролем. ЯЦО в обеих группах сохранялось на уровне, характерном для высокодифференцированных гепатоцитов [22]. V. Aleksiichuk и соавт. изучали токсичность НЧ сульфида свинца (в дозе 1,08 мг/кг м.т., 12 нед) и отметили увеличение ЯЦО, что, по мнению авторов, свидетельствует о снижении функциональной активности клеток [19]. Это позволяет предположить, что влияние химического соединения, используемой концентрации и продолжительности экспозиционного периода играет определяющую роль в оценке гепатотоксического действия НЧ.

Наиболее значимые изменения обнаружены на субклеточном уровне. Выявленное смещение митохондриального профиля гепатоцитов в сторону патологически изменённых морфотипов может свидетельствовать о повышении митохондриальной проницаемости, транслокации белка BAX на митохондриальную мембрану и нарушении её потенциала. Это согласуется с данными о способности НЧ металлов накапливаться в митохондриях, вызывая оксидативный стресс и разобщение окислительного фосфорилирования [7, 14, 21, 23].

Нарушение нормального функционирования митохондриального аппарата – один из триггеров апоптоза. Обнаруженное значительное увеличение экспрессии гена bax в печени крыс подтверждает активацию митохондриального пути апоптоза, поскольку белок BAX способствует повышенной проницаемости митохондрий [24, 25]. Это объясняет увеличение числа дегенеративно изменённых гепатоцитов и гистологические признаки повреждения без массового некроза.

Выявленный комплекс изменений говорит об избирательной митохондриально опосредованной гепатотоксичности НЧ PbO.

Ограничением исследования выступает использование в эксперименте лабораторных животных, принадлежащих к одному виду и полу.

Заключение

Ингаляционное воздействие НЧ PbO в концентрации 0,2 мг/м³ в течение четырёх месяцев индуцировало у самок крыс гепатотоксическое действие, ключевым механизмом которого является митохондриальный путь запуска апоптоза. Патологические изменения в печени подтвердились данными анализа мазков-отпечатков и гистологического исследования, которые указывают на воспалительные и дистрофические изменения в печени.

Полученные данные вносят вклад в понимание патогенеза хронической интоксикации НЧ PbO и формируют основу для разработки научно обоснованных мер профилактики профессиональных и экологически обусловленных рисков для здоровья.

¹ ГОСТ 33216–2014. Руководство по содержанию и уходу за лабораторными животными. Правила содержания и ухода за лабораторными грызунами и кроликами. М., 2016. 17 с.

² Методические рекомендации № 2939–83. К применению морфологических исследований при экспериментальном обосновании гигиенических нормативов вредных веществ в воздухе рабочей зоны: утверждены и введены в действие Приказом заместителя Главного государственного санитарного врача СССР А.И. Заиченко от 22 ноября 1983 г. № 2939–83. введён впервые, дата введения 22.11.1983 г. разработан под руководством профессора Н.Н. Литвинова коллективом авторов. Москва: Типография ВЦИО, 1983.

³ Мяделец О.Д. Гистология, цитология и эмбриология человека: [учебник]: в 2 ч. Ч. 1: Цитология, эмбриология и общая гистология. М-во здравоохранения Республики Беларусь, Витебский гос. мед. ун-т. Витебск (ВГМУ), 2014. 439 с.