Ремоделирование миокарда и микроциркуляторного русла при пылевой патологии лёгких как морфологический субстрат профессиональной кардиомиопатии у шахтёров

Введение

Сердечно-сосудистая патология часто встречается как причина смертности и преждевременной инвалидизации работников угледобывающей промышленности. Согласно данным научной литературы, до 60% случаев сердечно-сосудистой смерти у шахтёров не имели классических признаков острого коронарного синдрома или критического атеросклероза венечных артерий [1–6]. Это свидетельствует о наличии иных, неишемических механизмов повреждения миокарда. В многочисленных исследованиях накапливались данные о поражении сердечной мышцы у работников пылевых профессий [7, 8]. Однако в этих работах полностью отсутствует достоверное подтверждение состояния коронарных артерий, что делает неправомочным автоматическое отнесение этих случаев к группе ишемической болезни сердца (ИБС). Ещё в 1964 г. А.А. Земец описал у шахтёров крупные перинуклеарные гранулы тёмно-коричневого цвета в кардиомиоцитах, однако объяснения данному феномену дано не было [9].

В современной научной литературе главным патогенетическим звеном считается патология эндотелия, приводящая к дисфункции, с развитием дисбаланса оксида азота (NO) [10, 11]. Важнейшим компонентом патогенеза, связывающим пылевое воздействие с эндотелиальной дисфункцией (ЭД), является оксидативный стресс. Как показано в работе Б.Т. Величковского [12], при активации фагоцитов пылевыми частицами происходит генерация активных форм кислорода, повреждающих клетки. В последние годы внимание исследователей привлекал феномен эндотелиально-мезенхимальной трансформации (EndMT) – процесса, при котором эндотелиальные клетки утрачивали свои специфические маркёры и приобретали мезенхимальный фенотип, начиная вырабатывать внеклеточный матрикс [13, 14]. Этот процесс до недавнего времени считался главным патоморфологическим механизмом в формировании фиброза, некробиоза мышечных волокон и склероза сосудистой стенки при различных патологических состояниях [15], а ведущую роль в нём играл липофусцин – гликолипопротеид, накапливающийся в лизосомах миокардиальных клеток. Долгое время его считали пассивным «пигментом старения» [16, 17], однако современные данные подтверждают, что липофусцин – конечный продукт перекисного окисления липидов с модификацией клеточных белков, которые клетка не может утилизировать [16]. Накопление липофусцина связано с оксидативным стрессом и может служить его достоверным морфологическим маркёром [16, 17]. Обнаружение липофусцина у шахтёров молодого возраста указывает на патологическое ускорение процессов свободнорадикального окисления. В новейшей литературе активно обсуждается роль воспалительного типа клеточной гибели – пироптоза, опосредованного активацией NLRP3-инфламмасомы, при хронических болезнях сердца [18, 19]. Угольно-породная пыль способна активировать макрофаги с повреждением лизосомальных мембран, что признано классическим триггером сборки инфламмасомы. Однако отсутствуют прямые иммуногистохимические доказательства пироптоза в миокарде шахтёров, и это требует дальнейшего изучения. Комплексные исследования последних лет продемонстрировали системный характер сосудистых изменений у шахтёров, в том числе гипертрофию гладкомышечного слоя артериол, эндотелиоз и периваскулярный фиброз не только в лёгких, но и в миокарде, почках, печени. Эти изменения развивались параллельно с гипертрофией кардиомиоцитов и накоплением липофусцина, что позволяет говорить о формировании специфической кардиомиопатии профессионального генеза [20–27].

Цель исследования – комплексное морфологическое, гистохимическое и иммуногистохимическое обоснование выделения пылевой кардиомиопатии как самостоятельной нозологической формы с определением роли эндотелиальной дисфункции, оксидативного стресса, гипертрофии миокарда, липофусциноза и эндотелиально-мезенхимальной трансформации в её патогенезе.

Материалы и методы

Дизайн исследования. Проведено ретроспективное патоморфологическое исследование аутопсийного материала, полученного при судебно-медицинских экспертизах в Кемеровской области за период 2007–2023 гг.

Основная группа. В основную группу включены 80 шахтёров основных профессий угледобывающей отрасли (проходчики, горнорабочие очистного забоя, подземные электрослесари, машинисты горно-выемочных машин), погибших в результате техногенных катастроф и несчастных случаев на производстве. Критерии включения: документально подтверждённый стаж подземной работы от 1 года до 30 лет, наличие патоморфологических признаков пневмокониоза по данным аутопсии, отсутствие прижизненного диагноза ИБС, гипертонической болезни или других кардиологических патологий. Группа стратифицирована на четыре подгруппы в зависимости от стажа: группа I – стаж от 1 года до 5 лет (n = 20); группа II – стаж 6–11 лет (n = 20); группа III – стаж 12–20 лет (n = 20); группа IV – стаж более 20 (до 30) лет (n = 20). Возраст шахтёров – от 22 до 64 лет (Me = 44,5 года).

Контрольная группа. Эту группу составили 30 лиц мужского пола, погибших в результате автодорожных катастроф или внезапной смерти, не связанной с болезнями системы кровообращения или болезнями органов дыхания. Критерий включения: отсутствие профессионального контакта с промышленными аэрозолями. Для обеспечения сопоставимости по возрасту с основной группой контрольная группа разделена на две подгруппы: Контроль-1 (n = 15) для оценки исходных морфологических параметров – молодой возраст (от 20 до 35 лет; Me = 28,1 года); Контроль-2 (n = 15) для оценки возрастных изменений миокарда, не связанных с профессиональным воздействием, – средний возраст (от 36 до 55 лет; Me = 45,2 года). Важное дополнение: в протоколах судебно-медицинских экспертиз зафиксировано отсутствие инвазивных реанимационных мероприятий (внутрисердечных инъекций, интубации трахеи с ИВЛ, длительного непрямого массажа сердца) как в основной, так и в контрольной группах. Время от момента травмы до констатации смерти в обоих случаях не превышало 5–10 мин, вскрытие проводилось в первые 24 ч при хранении тела в холодильной камере.

Для исследования использовали множественные образцы миокарда левого и правого желудочков, межжелудочковой перегородки, а также фрагменты коронарных артерий (передняя нисходящая, огибающая, правая коронарная) для оценки степени атеросклеротического поражения. Дополнительно исследовали фрагменты лёгких, почек, печени для оценки системности сосудистых изменений. Определяли массу сердца. Материал фиксировали в 10%-м нейтральном забуференном формалине, обезвоживали в спиртах возрастающей крепости и заливали в парафин. Серийные срезы толщиной 4–5 мкм окрашивали: гематоксилином и эозином (общая оценка), пикрофуксином по Ван-Гизону (определение коллагена), по Касону и Гейденгану (оценка эластического каркаса сосудов), суданом чёрным B (полуколичественная оценка содержания липофусцина).

Иммуногистохимические методы. Исследования проводили с использованием системы визуализации на основе полимерного комплекса с пероксидазой хрена и диаминобензидина. Применяли моноклональные антитела: CD34, CD31 (маркёры эндотелия), α-SMA (маркёр миофибробластов), TGF-β1 (фактор фиброгенеза), Bcl-2 (регулятор апоптоза). Оценку экспрессии CD31 и CD34 в периваскулярных зонах проводили полуколичественно (0 – отсутствие; 1+ – слабая; 2+ – умеренная; 3+ – выраженная) с подсчётом количества иммунопозитивных клеток за пределами эндотелиальной выстилки.

Морфометрический анализ. Анализ проводили с использованием программного обеспечения BioVision 4.0 и Nikon NIS-Elements, микроскопии Olympus CX 31. Оценивали толщину стенки сосуда (мкм) для калибров < 50; 50–100 и 100–250 мкм; среднюю площадь ядер эндотелиоцитов (мкм²); толщину периваскулярного фиброза (мкм); индекс Керногана как отношение удвоенной толщины стенки к наружному диаметру сосуда (2Т/D); объёмную долю интерстициального фиброза (%) методом точечного счёта; диаметр кардиомиоцитов (мкм) на уровне ядра; площадь ядер кардиомиоцитов с вычислением ядерно-цитоплазматического отношения; накопление липофусцина в баллах (от 0 до 3) и в мкм² (площадь гранул в цитоплазме) в 10 полях зрения при увеличении ×400; массу сердца (г).

Статистическая обработка проведена с использованием непараметрических методов (U-критерий Манна – Уитни, H-критерий Крускала – Уоллиса, корреляционный анализ Спирмена) в IBM SPSS Statistics 22 (лицензионный договор № 20/604/3-1 от 22.04.2016 г.). Статистически значимыми считали различия при p < 0,05. При множественных сравнениях применяли поправку Бонферрони (уровень значимости α = 0,05/6 = 0,0083 для шести групп; в таблицах приведены номинальные значения p, но значимыми после коррекции считаются различия при p < 0,0083).

Для группы I (стаж от 1 года до 5 лет) иммуногистохимическое исследование Bcl-2 и морфометрия интерстициального фиброза выполнены на 15 из 20 образцов (в пяти случаях объём материала был недостаточен для указанных методов); полученные средние значения представлены как оценочные.

Результаты

Макроскопическое исследование коронарных артерий. При макроскопическом и гистологическом исследовании коронарных артерий в группе шахтёров не было выявлено гемодинамически значимых стенозов. Для полуколичественной оценки использована классификация Американской ассоциации сердца (AHA): 0 – интима не изменена; 1 – липидные пятна (полоски); 2 – фиброзная бляшка без стеноза или стеноз < 30%; 3 – фиброзная бляшка со стенозом 30–50%; 4 – стеноз > 50% или осложнённая бляшка. В 68 из 80 случаев (85%) атеросклеротические изменения отсутствовали или были представлены единичными липидными пятнами и полосками (тип 0–1), не суживающими просвет сосуда. В 12 случаях (15%) обнаружены единичные фиброзные бляшки (тип 2), стенозирующие просвет не более чем на 25–30%. Нестабильных, морфологически значимых атеросклеротических бляшек (тип 3–4) не выявлено. В группе Контроль-2 частота встречаемости и степень выраженности атеросклероза коронарных артерий были сопоставимы с таковыми у шахтёров (p > 0,05). Таким образом, процесс в артериях не может объяснить морфологических изменений миокарда у шахтёров.

Гистологическая картина. В контрольной группе структура миокарда была сохранена: кардиомиоциты с чёткой поперечной исчерченностью, центрально расположенными ядрами, строма представлена тонкими прослойками соединительной ткани. Сосуды с тонкими стенками, эндотелий уплощён, периваскулярный фиброз отсутствовал или был минимальным (в Контроле-2). У шахтёров в группе I (стаж от 1 года до 5 лет) определялись начальные признаки эндотелиального повреждения: гиперхромия и чёткое увеличение ядер эндотелиоцитов, неровность контуров ядра, выбухание цитоплазмы в просвет сосуда с формированием частоколообразных структур (эндотелиоз). В периваскулярных пространствах имелись фибропластические изменения. Морфометрический анализ выявил стажезависимое прогрессирование ремоделирования сосудов (табл. 1).

Корреляционный анализ выявил зависимость между площадью эндотелиальных клеток и толщиной периваскулярного фиброза (rs = 0,833; p < 0,01), а также между толщиной стенки и индексом Керногана (rs = 0,791; p < 0,01).

Гипертрофия миокарда и липофусциноз. Во всех группах шахтёров наблюдалась гипертрофия кардиомиоцитов, наиболее выраженная в группах II и III. Масса сердца значительно увеличивалась, достигая в группе III 530–580 г, что превышало нормальные значения (до 350 г). В группе IV масса сердца была меньше (480–520 г) на фоне дистрофических изменений.

При гистологическом исследовании в кардиомиоцитах шахтёров уже при стаже от 1 года до 5 лет (группа I) выявлены перинуклеарные скопления гранул липофусцина тёмно-коричневого цвета, дающие положительную ШИК-реакцию и окрашивающиеся суданом черным B. В контрольной группе липофусцин отсутствовал (Контроль-1) или был минимален (Контроль-2).

Количественный анализ показал стажезависимое увеличение объёма липофусцина (табл. 2). Максимальное накопление пигмента зафиксировано в группе II (стаж 6–11 лет), после чего в группе III и IV отмечалось плато со снижением в группе IV, вероятно, вследствие гибели наиболее поражённых липофусцин-содержащих клеток, что приводило к уменьшению средней площади пигмента на одну выжившую клетку (см. табл. 2). Таким образом, снижение показателя в группах III и IV не противоречит продолжающемуся накоплению липофусцина в отдельных кардиомиоцитах, а отражает элиминацию клеток с максимальной пигментной нагрузкой.

Оценка апоптоза и клеточного стресса. Иммуногистохимическое исследование с маркёром Bcl-2 выявило статистически значимое повышение его экспрессии в цитоплазме кардиомиоцитов шахтёров групп II, III и IV по сравнению с контролем (p < 0,01). Экспрессия носила очаговый характер и была наиболее выражена в клетках, содержащих крупные скопления липофусцина, а также в миофибробластах зон периваскулярного фиброза. Обнаружена сильная положительная корреляция между объёмом липофусцина и оптической плотностью экспрессии Bcl-2 (rs = 0,85; p < 0,001). Повышение Bcl-2 свидетельствует об активации компенсаторных цитопротективных механизмов в условиях хронического оксидативного стресса.

Эндотелиально-мезенхимальная трансформация (EndMT). При исследовании не только сердца, но и других органов (лёгкие, почки, печень) у шахтёров выявлены однотипные изменения сосудистого русла. Иммуногистохимическое исследование с маркёрами эндотелия CD31 и CD34 выявило не только усиление экспрессии в эндотелиоцитах, но и появление позитивных клеток за пределами сосудистой стенки. В контрольной группе экспрессия CD31 и CD34 была строго ограничена эндотелиальной выстилкой. У шахтёров группы I единичные клетки CD34⁺ появлялись в периваскулярных пространствах. В группах II, III и IV количество таких клеток резко возрастало, они имели веретеновидную форму, формировали скопления в адвентиции и зонах фиброза, ко-экспрессируя α-SMA (маркёр миофибробластов). Этот феномен – эндотелиально-мезенхимальная трансформация – указывает на то, что часть фибробластов (миофибробластов), продуцирующих коллаген в периваскулярных зонах, имеет эндотелиальное происхождение. Количественный анализ показал стажезависимое увеличение доли микрососудов с периваскулярными клетками, экспрессирующими моноклональные антитела CD34 и α-SMA: с 4,2 ± 1,8% в группе I до 31,2 ± 6% в группе IV (p < 0,05 при попарных сравнениях) (табл. 3).

В настоящем исследовании не проводилась иммуногистохимическая верификация маркёров пироптоза (каспаза-1, газдермин D, NLRP3), однако с учётом новейших данных о роли инфламмасомы NLRP3 в развитии кардиомиопатий при хроническом воспалении [18, 19], а также морфологических признаков, косвенно указывающих на воспалительный тип повреждения клеток (набухание макрофагов, гиперхроматоз ядер, неровность ядерной мембраны, инфильтрация нейтрофилами), мы рассматриваем пироптоз как гипотетический механизм, требующий специального изучения в будущем.

Обсуждение

Полученные результаты доказывают существование специфического поражения миокарда у шахтёров, которое трудно объяснить в рамках традиционной ишемической болезни сердца (ИБС) или лёгочного сердца. Проведённое исследование на аутопсийном материале подтверждает структурные изменения эндотелия, носящие системный характер и имеющие связь со стажем. Принципы, заложенные классиками отечественной патологической анатомии А.И. Абрикосовым и И.В. Давыдовским, подчёркивают первостепенную роль аутопсии в объективной оценке патологических процессов. Морфологическим эквивалентом дисфункции является эндотелиоз – гипертрофия и гиперплазия эндотелиоцитов, приводящие к сужению просвета сосудов, что подтверждается увеличением индекса Керногана. Утолщение сосудистой стенки происходит за счёт гипертрофии гладкомышечного слоя и периваскулярного фиброза, а не за счёт атеросклеротических бляшек. Это принципиально отличает выявленную патологию от ИБС. Системность поражения эндотелия (в сосудах лёгких, сердца, почек) позволяет рассматривать пылевую кардиопатию как часть генерализованной профессиональной ангиопатии.

Выявленная стажезависимая гипертрофия кардиомиоцитов (рост диаметра с 14,8 мкм в контроле до 20 мкм в группе III) отражает компенсаторную реакцию на повышенную нагрузку и хроническую гипоксию. Увеличение массы сердца до 530–580 г подтверждает выраженность гипертрофических процессов. Изменения в группе IV (стаж более 20 лет) регистрируют снижение диаметра кардиомиоцитов и массы сердца, что свидетельствует о дистрофических изменениях и истощении компенсаторных механизмов.

Выявленное накопление липофусцина в перинуклеарной зоне кардиомиоцитов является ключевым доказательством хронического оксидативного стресса. Принципиально важно, что у шахтёров группы I (стаж от 1 года до 5 лет, средний возраст 25–30 лет) площадь липофусцина достигала 143,7 мкм², тогда как в группе Контроль-1 он отсутствовал, а в группе Контроль-2 (средний возраст 36–55 лет) составлял лишь 12,4 мкм². Это свидетельствует о патологическом, а не инволютивном характере процесса. В норме липофусцин начинает накапливаться после 60–70 лет, и его присутствие у молодых шахтёров доказывает ускоренное старение миокарда под влиянием профессиональных факторов. Снижение средней площади липофусцина в группах III и IV относительно высоких показателей в группе II объясняется не уменьшением пигмента в каждой клетке, а гибелью патологически поражённых кардиомиоцитов. Этот эффект научно доказан и известен при хроническом оксидативном стрессе. Выявленное повышение антиапоптотического белка Bcl-2 в клетках, содержащих липофусцин, следует рассматривать как компенсаторную реакцию, направленную на выживание кардиомиоцитов в условиях стресса.

Ведущим открытием, объясняющим прогрессию фиброза, является наличие признаков EndMT. Положительная детекция CD31/CD34 в периваскулярных зонах, их ко-экспрессия с α-SMA показывают, что эндотелий при хроническом воздействии пыли становится источником клеток с фиброгенными эффектами. Этот патогенетический механизм впервые продемонстрирован в миокарде шахтёров. Количественно доля сосудов с экспрессией CD34⁺/α-SMA+ возрастала с 4,2% при стаже от 1 года до 5 лет до 31,2% при стаже более 20 лет, что подтверждает прогрессирующий характер EndMT.

Что касается пироптоза, то, несмотря на отсутствие прямых ИГХ-доказательств в настоящем исследовании, его возможная роль в патогенезе пылевой кардиомиопатии обсуждается в современной литературе. Высвобождение катепсина B из повреждённых лизосом макрофагов при фагоцитозе кварцсодержащей пыли признано классическим триггером NLRP3-инфламмасомы. В дальнейших исследованиях мы планируем провести ИГХ-верификацию маркёров пироптоза (NLRP3, каспаза-1, газдермин D) на аналогичном материале.

Ограничения исследования. Необходимо подчеркнуть, что аутопсия остаётся «золотым стандартом» установления причины смерти и основным методом патоморфологической диагностики. Экспериментальные исследования на животных, общепризнанные в доказательной медицине, также завершаются этапом аутопсии, сопряжённым со стрессом и агональными изменениями, однако это не ставит под сомнение достоверность полученных в них данных. Более того, расхождения клинического и аутопсийного диагнозов достигали 61% в ряде выборок, что подтверждает необходимость морфологической верификации. Проведённое исследование имеет ряд ограничений, связанных с ретроспективным дизайном, региональной выборкой (Кузбасс) и использованием аутопсийного материала погибших при техногенных катастрофах. Указанные ограничения определяют необходимость дальнейших научных исследований в рамках данной тематики с прижизненной оценкой биомаркёров системного поражения эндотелия и фиброза.

Заключение

Проведённое научное исследование позволяет обосновать существование специфической формы вторичного поражения сердца профессиональной этиологии – пылевой кардиомиопатии.

1. На основании комплекса морфологических, морфометрических и иммуногистохимических данных доказано, что пылевая кардиомиопатия является самостоятельной нозологической формой, отличной от ИБС. У шахтёров отсутствовал достоверно значимый атеросклероз коронарных артерий, сопоставимый с возрастным контролем.
2. Подтверждён системный характер поражения эндотелия, проявляющийся эндотелиозом, утолщением сосудистой стенки за счёт гипертрофии гладкомышечного слоя и повышением индекса Керногана. Эти изменения прогрессировали со стажем и приводили к обструктивной ангиопатии микроциркуляторного русла.
3. Выявлена стажезависимая динамика гипертрофии кардиомиоцитов (максимум при стаже 12–20 лет) с последующим переходом в дистрофию и атрофию при стаже более 20 лет, что сопровождалось увеличением массы сердца до 530–580 г и последующими его дегенеративными изменениями.
4. Центральным звеном патогенеза является хронический оксидативный стресс, морфологическим маркёром которого выступает стажезависимое накопление липофусцина в перинуклеарной зоне кардиомиоцитов. Выявленный уровень липофусциноза у шахтёров достоверно превышал показатели возрастного контроля уже при стаже от 1 года до 5 лет, что подтверждает патологическое, а не возрастное развитие патологического процесса. Снижение средней площади липофусцина в группах III и IV относительно высоких показателей в группе II обусловлено гибелью клеток с максимальной пигментной нагрузкой.
5. Впервые в миокарде шахтёров продемонстрированы морфологические признаки EndMT (эктопическая экспрессия CD31/CD34 в периваскулярных зонах с экспрессией α-SMA), объясняющей прогрессирующий периваскулярный фиброз как следствие профессионального пылевого воздействия. Доля сосудов с экспрессией CD34⁺/α-SMA+ возрастала до 31,2% в группе с максимальным стажем.
6. Повышение экспрессии антиапоптотического белка Bcl-2 в кардиомиоцитах, содержащих липофусцин, оценивается как компенсаторная реакция клетки на стресс, приводящая к их гибели при снижении адаптационных резервов.
7. Предложена и обоснована морфологическая триада для патоморфологического подтверждения пылевой кардиомиопатии: эндотелиоз сосудов, периваскулярный фиброз, диффузный липофусциноз кардиомиоцитов.
8. Полученные морфологические данные создают научную основу для выделения пылевой кардиомиопатии как самостоятельной нозологической формы профессионального генеза, что должно быть учтено при последующих пересмотрах международной классификации болезней (МКБ-11 и её актуализации) и при разработке клинических рекомендаций по диагностике и экспертизе профессиональных болезней сердца. Для окончательного утверждения данной нозологической единицы необходимы дальнейшие клинические и эпидемиологические исследования с прижизненной верификацией диагностических критериев (эхоКГ, МРТ сердца, биомаркёры).

Перспективы дальнейших исследований

Обнаруженные патоморфологические признаки (липофусциноз, периваскулярный фиброз, эндотелиоз, стажезависимая гипертрофия кардиомиоцитов с последующей дистрофией) позволяют предположить участие воспалительных механизмов клеточной гибели, в том числе пироптоза, в патогенезе пылевой кардиомиопатии. Однако для подтверждения этой гипотезы необходимы дополнительные иммуногистохимические исследования с маркёрами NLRP3, каспазы 1 и газдермина D на аналогичном материале.