Анализ цито- и генотоксичности водных экстрактов торфяного дыма in vitro

Введение

Природные пожары (ПП) относятся к наиболее значительным источникам выбросов загрязняющих веществ в атмосферу [1, 2]. В условиях изменения климата частота и интенсивность пожаров неуклонно растут. Согласно прогнозам, вследствие глобальных изменений температуры и режима осадков во многих регионах мира ожидается увеличение активности ПП [3], что делает изучение их последствий приоритетной задачей экологической медицины и токсикологии. Дым ПП представляет собой сложную смесь твёрдых частиц (ТЧ) и газов, показатели токсичности которой варьируются в зависимости от температуры горения, типа топлива, расстояния от источника и других факторов [4–6]. Так, например, Young T.M. и соавт. сравнили состав органических соединений в золе из городских и природных зон, пострадавших от лесного пожара [7]. Авторы показали, что вопреки ожиданиям наибольшие концентрации полициклических ароматических углеводородов (ПАУ) наблюдались в золе из природной зоны. При воздействии экстрактов этой золы на моноцитарные клетки человека U937 было зафиксировано повышение уровней циклооксигеназы-2, интерлейкина-8, CYP1A1 (маркёра метаболизма ксенобиотиков) и активация арилуглеводородного рецептора, что свидетельствует о токсическом и воспалительном потенциале продуктов сгорания природной биомассы.

Температура оказывает существенное влияние на дымовые продукты всех источников. Известно, что тление приводит к преобладанию ТЧ, а при горении образуется больше газообразных выбросов. Эти закономерности подтверждены на различных видах топлива: дуб, торф, сосновая хвоя и сосновая древесина [6], эвкалипт [5]. Количественная оценка, проведённая в этом же исследовании, показала, что концентрация ТЧ при тлении может в десять раз превышать таковую при горении, тогда как уровни CO₂ и NO₂ в 1000 раз выше в условиях горения.

В работе Deering-Rice C.E. и соавт. было показано, что активация канала транзиторного рецепторного потенциала TRPV3, участвующего в клеточном ответе на компоненты дыма и рассматриваемого как ранний маркёр пневмотоксичности, зависит от вида сжигаемой древесины [8], что подчёркивает необходимость сравнительного анализа различных источников дыма. В связи с этим результаты, полученные для одного типа пожаров, не могут быть экстраполированы на другие. Особый интерес представляет исследование торфяного дыма, образующегося при длительном тлении.

Большинство исследований сосредоточено на количественном измерении концентраций выбрасываемых газов и ТЧ [9–11], известных своим неблагоприятным биологическим воздействием, однако остаётся неясным, является ли причиной этого воздействия более высокая концентрация самих частиц (особенно мелкодисперсной фракции) с адсорбированными на их поверхности токсичными соединениями или же действие газообразных выбросов. Поскольку разделить эти факторы в эпидемиологических исследованиях практически невозможно, для решения данной задачи широко используются экспериментальные подходы in vivo и in vitro.

Модели in vitro широко применяются для скрининга начальных токсикологических эффектов. Эти системы дают возможность изучать клеточные и молекулярные механизмы токсичности, что необходимо для понимания патогенетических путей развития болезней, особенно при использовании различных типов клеток. Идентификация наиболее опасных компонентов выбросов позволяет получить данные, необходимые для научного обоснования нормативных рекомендаций в области общественного здравоохранения и профилактики. В настоящем исследовании применение модели in vitro в контролируемых условиях направлено на идентификацию вклада различных компонентов дыма в токсический эффект путём использования нефильтрованных и фильтрованных экстрактов.

В качестве клеточной модели для оценки токсичности дыма были выбраны фибробласты. Эти клетки играют ключевую роль в репарации тканей после воспалительных и токсических повреждений лёгких, участвуя в синтезе компонентов внеклеточного матрикса и регуляции процессов заживления. Хроническое повреждение альвеолярного эпителия, сопровождающееся воспалением и последующим фиброзом, представляет собой единый динамический процесс, в котором фибробластам принадлежит роль центрального звена. Данные о токсическом действии компонентов дыма на макрофаги и эпителиальные клетки обширны [12–14], при этом исследования, посвящённые влиянию на фибробласты, единичны. Исследование цитотоксического, генотоксического и эпигенетического действия экстрактов торфяного дыма на фибробластах позволит оценить потенциальное влияние компонентов дыма на процессы репарации лёгочной ткани.

Цель настоящего исследования – анализ цитотоксичности, уровня фрагментации и метилирования ДНК фибробластов методом ДНК-комет после воздействия нефильтрованного и фильтрованного водного экстракта торфяного дыма (ЭТД).

Материалы и методы

ЭТД получали с использованием ранее разработанного нами способа оценки токсичности продуктов горения биомассы [15]. Торф массой 20 г подвергали термодеструкции, а образующийся дым направляли в экспозиционную камеру объёмом 200 л, где путём разбавления чистым воздухом достигали целевого уровня задымления: кислород (О₂) 19,1 (19; 19,2)%, монооксид углерода (СО) – 21 (13; 28) мг/м³_, РМ_2,5 – 0,09 (0,04; 0,19) мг/м³_. В пробах воздуха каждые 15 мин на газоанализаторе ГАНК-4 (НПО «Прибор», Россия) регистрировали эти показатели с использованием анализатора аэрозоля DustTrak 8533 (TSI Inc., США).

Основной поток торфяного дыма, выходящего из экспозиционной камеры при пониженном давлении, создаваемом с помощью двух аспирационных насосов (скорость потока 5 л/мин), был разделён с помощью соединительной V-образной стеклянной трубки. На одном конце трубки был установлен фильтродержатель закрытого типа с фильтром АФА-ВП (коэффициент проскока для частиц размером 0,1 мкм 0,1%), позволяющим получить преимущественно водорастворимые газовые компоненты. Основной поток и отфильтрованный поток торфяного дыма барботировали соответственно в две отдельные аликвоты питательной среды DMEM (по 5 мл) в течение 30 мин при температуре плюс 25 °C, получая при этом Ф-ЭТД и НФ-ЭТД. Затем рН полученных экстрактов доводили до рН среды DМЕМ, пробы аликвотировали и хранили при температуре минус 70 °С. НФ-ЭТД и Ф-ЭТД, полученные после барботирования, принимали за 100%-е исходные растворы (без разведения). Для оценки концентрационной зависимости эффектов готовили рабочие разведения экстрактов на питательной среде DMEM. Обозначения разведений приведены в формате «экстракт : среда» (объём/объём):

• 1 : 3 – 1 часть экстракта и 3 части среды (соответствует 25%-му содержанию исходного экстракта);
• 1 : 1 – 1 часть экстракта и 1 часть среды (соответствует 50%-му содержанию исходного экстракта);
• 3 : 1 – 3 части экстракта и 1 часть среды (соответствует 75%-му содержанию исходного экстракта);
• без разведения – исходный 100%-й экстракт.

Все разведения готовили непосредственно перед внесением в клетки.

Идентификацию летучих органических соединений и альдегидов в полученных экстрактах проводили методом газовой хромато-масс-спектрометрии (ГХ-МС) с помощью системы Agilent 5975C с одноквадрупольным масс-спектрометром, оснащённой капиллярной колонкой HP-5MS (30 м × 0,25 мм × 0,25 мкм), автосамплером жидких образцов и дозатором равновесного пара ДРП-4.

Методика выполнения эксперимента для идентификации летучих органических соединений. Во флакон для парофазного анализа объёмом 20 мл помещали 1 мл НФ-ЭТД, герметично закрывали алюминиевой крышкой с тефлоново-силиконовой септой и термостатировали в дозаторе ДРП-4 при температуре плюс 80 °C в течение 25 мин. Затем газоплотным шприцем отбирали 0,6 мл равновесной паровой фазы и вводили в инжектор хромато-масс-спектрометра.

Методика выполнения эксперимента для идентификации летучих альдегидов. во флакон объёмом 2 мл помещали 1 мл НФ-ЭТД и 100 мкл 0,5%-го водного раствора о-пентафторбензилгидроксиламина (ПФБГА), выдерживали при температуре плюс 60 °C в течение 30 мин для дериватизации. После охлаждения продукты экстрагировали изооктаном (1 мл) в течение 1 мин. По завершении разделения фаз органический слой отбирали и помещали во флакон для жидких образцов. Идентификацию соединений проводили путём сравнения полученных масс-спектров с библиотечными базами данных NIST и линейных индексов удерживания с данными литературы. Для расчёта линейных индексов удерживания использовали смеси н-алканов С10–С13.

Трансформированные эмбриональные фибробласты мыши 3T3-SV40 получены из Российской коллекции клеточных культур позвоночных Института цитологии РАН. Клетки культивировали в среде DMEM (ООО «Биолот», Россия) с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки (Research Grade, Новая Зеландия) в присутствии 100 Ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина (ООО «Биолот», Россия). До воздействия ЭТД фибробласты 3T3-SV40 инкубировали в лунках 96-луночного планшета в посевной концентрации 100 тыс. клеток на лунку планшета в течение 24 ч в условиях 5%-го CO₂ при температуре плюс 37 °C для прикрепления ко дну планшета и образования монослоя. Клетки использовали между 6–12 пассажами.

Цитотоксическое действие ЭТД на клетки фибробластов 3T3-SV40 оценивали с помощью теста на исключение красителя 0,4%-го трипанового синего, а влияние на метаболическую активность – с применением МТТ-теста. Эксперимент проводили в четырёх независимых опытах с четырьмя параллельными пробами для всех исследуемых разведений. В качестве контроля использовали лунки с интактными клетками, а в качестве холостой пробы – лунки с питательной средой без клеток. После формирования монослоя культуральную среду удаляли и в лунки вносили по 100 мкл Ф-ЭТД и НФ-ЭТД. Далее проводили анализ согласно протоколу, описанному в нашей работе [16]. Оценку результатов МТТ-теста проводили путём сопоставления оптической плотности в опытных и контрольных лунках за вычетом среднего значения холостой пробы.

Исследование фрагментации ДНК методом ДНК-комет в щелочной версии проводили также после 24-часовой инкубации культуры фибробластов с НФ-ЭТД и Ф-ЭТД [17, 18]. Уровень полногеномного метилирования оценивали методом ДНК-комет с модификациями с использованием рестриктаз MspI и HpaII («СибЭнзим», Россия) [19]. При использовании обеих методик клетки открепляли с помощью раствора трипсин-версен (1 : 3), центрифугировали и двукратно промывали питательной средой DМЕМ для удаления раствора трипсин-версена. Для анализа одного образца использовали 60 мкл раствора с промытыми фибробластами. Окрашивали флуоресцирующим красителем SYBR Green I (Invitrogen, США). Визуализацию проводили на микроскопе Olympus BX-51, совмещённом с цифровой камерой высокого разрешения Olympus RX-420 (OLYMPUS Co., Япония) при увеличении ×100. Изображения ДНК-комет анализировали с использованием программного обеспечения CASP 1.2.2 в количестве 100 ядер для каждого стекла. В качестве показателя фрагментации ДНК использовали процентное содержание ДНК в хвосте ДНК-комет (%ДНК в хвосте комет). Уровень полногеномного метилирования высчитывали по формуле (1):

100 – (HpaII / MspI ∙ 100),                          (1)

где HpaII и MspI – процент ДНК в хвосте кометы на препаратах, обработанных HpaII и MspI соответственно.

Для принятия решения о виде распределения признаков использовали W-критерий Шапиро – Уилка. Для сравнения независимых групп применяли U-критерий Манна – Уитни. Данные представлены как медиана и интерквартильные размахи (Q₁; Q₃).

Результаты

Качественный химический анализ летучих соединений проводили для НФ-ЭТД, поскольку данный образец содержит полный спектр компонентов дыма (как ТЧ, так и водорастворимые газовые соединения). На хроматограмме (рис. 1) значимых пиков, соответствующих летучим органическим соединениям, не обнаружено.

В ходе химического анализа в НФ-ЭТД были идентифицированы летучие альдегиды С1–С4, среди которых преобладали формальдегид и ацетальдегид (рис. 2).

Из таблицы видно, что в меньших количествах присутствовали пропаналь, изобутаналь и ацетон.

При оценке цитотоксичности методом исключения красителя статистически значимых различий в жизнеспособности клеток между контролем (94,64%) и группами, экспонированными Ф-ЭТД и НФ-ЭТД во всех исследованных разведениях, не выявлено (рис. 3). Однако следует обратить внимание на тенденцию к дозозависимому снижению жизнеспособности клеток в зависимости от типа экстракта. При воздействии Ф-ЭТД показатель жизнеспособности оставался стабильным при всех разведениях, составляя 88,7–89,89%, что демонстрирует отсутствие дозозависимого эффекта, а при воздействии НФ-ЭТД наблюдалось постепенное снижение жизнеспособности по мере увеличения концентрации: с 91,17% (при разведении 1 : 3) до 82,74% (без разведения). Наиболее выраженное снижение начиналось с разведения 1 : 1. При этом в группах НФ-ЭТД с разведением 1 : 3 и НФ-ЭТД с разведением 1 : 1 жизнеспособность клеток сохранялась на уровне, сопоставимом с группами, экспонированными Ф-ЭТД.

Перед МТТ-тестом была выполнена световая микроскопия планшета с клетками после 24-часовой инкубации. В лунках, подвергавшихся инкубации с Ф-ЭТД и НФ-ЭТД без разведения, монослой соответствовал контролю: клетки имели вытянутую форму, плотно прилегали друг к другу, зоны деструкции отсутствовали.

По результатам МТТ-теста наблюдалось плавное снижение метаболической активности клеток при применении ЭТД от наименьшего разведения (1 : 3) до наибольшего (без разведения). Наименьшее ингибирование метаболической активности по сравнению с контролем вызывал Ф-ЭТД в разведении 1 : 3 (снижение на 5%), в то время как НФ-ЭТД в том же разведении снижал данный показатель на 8%. Наиболее выраженное снижение данного показателя зафиксировано при инкубации клеток с Ф-ЭТД и НФ-ЭТД без разведения – на 16 и 21% соответственно (рис. 4).

Статистический анализ не выявил достоверных различий (p = 0,31) между эффектами Ф-ЭТД и НФ-ЭТД в разведениях 1 : 3, 1 : 1 и 3 : 1. При сравнении эффектов экстрактов без разведения отмечена тенденция к различию (p = 0,06). Таким образом, несмотря на отсутствие статистической значимости для отдельных разведений, наблюдаемая тенденция, согласующаяся с данными о жизнеспособности клеток, указывает на более выраженное влияние НФ-ЭТД на метаболическую активность клеток.

Поскольку выраженное цитотоксическое действие отсутствовало даже при максимальной концентрации экстрактов, дальнейший анализ фрагментации и метилирования ДНК проводили только для неразведённых образцов Ф-ЭТД и НФ-ЭТД. Уровень фрагментации ДНК в фибробластах, экспонированных Ф-ЭТД (р = 0,67) и НФ-ЭТД (р = 0,89), не имел достоверных отличий от контроля. Для Ф-ЭТД этот показатель составил 3,25 (2,69; 3,95)%, для НФ-ЭТД – 3,96 (3,45; 4,6)% ДНК в хвосте комет.

Уровень полногеномного метилирования фибробластов при воздействии ЭТД без разведения в группе НФ-ЭТД составил 23,5 (16,2; 24,8)%, что в 1,6 раза превышает медианное значение данного показателя в группе Ф-ЭТД – 14,5 (10,8; 20,9)%. Однако статистически значимых различий данного показателя в контрольной и опытных группах не обнаружено, уровень значимости для Ф-ЭТД составил p = 0,89, а для НФ-ЭТД p = 0,47.

Согласно результатам, представленным на рис. 5, однократное воздействие ЭТД без разведения не оказывает значимого влияния на показатели генотоксичности и эпигенетического статуса в культуре фибробластов in vitro.

Обсуждение

Исследования, в которых использовались методы in vitro для изучения токсических эффектов дыма от ПП, немногочисленны. В обзорах литературы [4, 21] не только обобщены имеющиеся данные о токсичности дыма ПП, но и выявлен ряд существенных недостатков проведённых исследований. К числу основных проблем были отнесены: фрагментарность данных о химическом составе дыма (например, Wegesser T.C. и соавт. анализировали только компонент ПАУ, тогда как данные о других химических компонентах воздействия дыма ПП не изучались [22]); отсутствие работ, оценивающих токсичность дыма и его составляющих (вклад газовой фазы и ТЧ) по отдельности; отсутствие данных о долгосрочных эффектах; значительная вариабельность экспериментальных подходов, затрудняющая сравнение результатов. Для устранения этих недостатков Black C. с соавт. предложили контролируемые экспериментальные исследования в сочетании с детальным анализом химического состава дыма, Dong T.T.T. и соавт. – разработку стандартизированных протоколов для получения сопоставимых данных и, что особенно важно, оценку токсичности дыма ПП как сложной многокомпонентной смеси.

Контролируемые экспериментальные исследования с применением моделей in vitro позволяют выявить ряд функциональных изменений в клетках. Так, при воздействии дыма от сжигания ели, сосны и лиственницы наблюдались блокировка пути аутофагии и снижение функций мышиных макрофагов, полученных из костного мозга, что ассоциировано с патогенезом ХОБЛ, а также снижение активации лимфоцитов, характерное для повышенной чувствительности к бактериальным инфекциям [12]. Сходные эффекты были обнаружены на эпителиальных клетках дыхательных путей при использовании дыма от сжигания эвкалипта и акации [13], а также при воздействии PM₁₀, собранных в зоне интенсивного использования древесного топлива, что приводило к нарушению способности моноцитарных макрофагов контролировать внутриклеточные патогены [23]. В ряде работ зарегистрировано повреждение ДНК под действием частиц дыма от сжигания пихты, бука и сосны [14, 24, 25]. Кроме того, на примере частиц от сжигания ели показаны эпигенетические изменения, ассоциированные с развитием астмы, рака лёгких и других болезней, связанных с воздействием ТЧ [26].

Важную роль в токсичности ТЧ играет их размер. Jalava P.I. и соавт. показали, что фракции частиц (PM_10–2,5 и PM_2,5–1) индуцируют в мышиных макрофагах RAW264.7 преимущественно воспалительный ответ (продукцию фактора некроза опухоли альфа, интерлейкина-6, макрофагального воспалительного белка-2), тогда как ультрамелкие частицы (PM_0,2) обладают более высокой апоптотической активностью [27]. Эти данные подтверждают, что частицы разного размера могут активировать различные сигнальные пути и вызывать качественно разные клеточные ответы. В настоящем исследовании мы не проводили фракционирование частиц по размеру, однако использовали фильтрацию для разделения ТЧ и газовой фазы, что позволило оценить вклад каждой фракции в отдельности.

В работе Ihantola T. и соавт. на клетках человеческого альвеолярного эпителия A549 и мышиных макрофагах RAW264.7 исследована генотоксичность древесного дыма двух типов древесины [28]. Авторы наблюдали статистически незначимое увеличение по сравнению с контролем количества разрывов цепей ДНК при воздействии как нефильтрованного дыма, так и фильтрованного через HEPA-фильтр, что согласуется с нашими данными об отсутствии значимых изменений уровня фрагментации ДНК в фибробластах после однократного воздействия экстрактов торфяного дыма. Наибольшее повреждение в исследовании [28] вызывал нефильтрованный дым ели (p = 0,058), а в случае исследования дыма сосны наблюдался сходный уровень повреждения ДНК при воздействии фильтрованного и нефильтрованного дыма. Авторы отмечают, что выбросы от сжигания сосны (концентрация РМ₁ = 7,7 ± 6,5 мг/м³) характеризовались большим размером частиц и более высокой массовой концентрацией по сравнению с елью (концентрация РМ₁ = 4,3 ± 5,1 мг/м³), что могло повлиять на различия в генотоксичности. Это наблюдение согласуется с данными других исследователей о более высокой токсичности мелких фракций ТЧ [21, 25].

Таким образом, несмотря на наличие отдельных работ, посвящённых токсичности дыма ПП, исследования, направленные на дифференциацию эффектов ТЧ и газовой фазы для такого вида топлива, как торф, практически отсутствуют. Торфяные пожары, моделируемые в настоящем исследовании, представляют особый интерес, поскольку они характеризуются длительным тлением, высоким выходом ТЧ и специфическим набором ПАУ и металлов [6]. В отличие от исследований, в которых использовали частицы, собранные из атмосферного воздуха [27], или золу, собранную на пепелищах [7], мы работали с экстрактами, полученными непосредственно при сжигании торфа в контролируемых условиях, что позволило минимизировать влияние посторонних факторов и сосредоточиться на компонентах, специфичных именно для торфяного дыма.

Проведённая в нашем эксперименте оценка цитотоксичности торфяного дыма с использованием метода исключения красителя и МТТ-теста не выявила статистически значимых различий между контролем и группами, экспонированными Ф-ЭТД и НФ-ЭТД во всех исследованных разведениях. Было установлено, что газовая фаза торфяного дыма (Ф-ЭТД) сама по себе способна вызывать умеренное снижение метаболической активности клеток (до 16% при максимальной концентрации), однако присутствие ТЧ усиливает этот эффект (до 21% для НФ-ЭТД). Вместе с тем важно отметить тенденцию к дозозависимому снижению жизнеспособности и метаболической активности клеток под действием НФ-ЭТД, тогда как для Ф-ЭТД такая зависимость отсутствовала. Можно предположить, что ТЧ в составе НФ-ЭТД вносят дополнительный вклад в цитотоксический эффект. Частицы, выступая в роли векторов для адсорбированных токсичных веществ и индукторов окислительного стресса, усиливают повреждение клеточных мембран и митохондрий, что приводит к большему снижению жизнеспособности клеток по сравнению с действием Ф-ЭТД. Вероятно, более выраженное цитотоксическое действие НФ-ЭТД обусловлено сочетанным эффектом растворимых токсикантов и ТЧ. Методом ДНК-комет не выявлено статистически значимого увеличения фрагментации ДНК в фибробластах после воздействия как Ф-ЭТД, так и НФ-ЭТД без разведения. Полученный результат несколько расходится с данными [14, 24, 25], которые наблюдали повреждение ДНК клеток человеческого альвеолярного эпителия A549, THP-1 линии моноцитарных клеток и мышиных макрофагов RAW264.7 при воздействии ТЧ древесного дыма. Возможное объяснение заключается в использовании различных клеточных моделей, концентраций и способов экспозиции. Кроме того, в указанных работах, как правило, применяли частицы, собранные на фильтры и ресуспендированные в среде, что могло приводить к агрегации и изменению их биодоступности. В нашем исследовании экспозиция осуществлялась путём барботирования дыма через культуральную среду, что не приводило к агломерации частиц.

Данные химического анализа позволяют уточнить возможные механизмы наблюдаемых эффектов. Идентифицированные в НФ-ЭТД альдегиды (ацетальдегид, формальдегид) являются генотоксичными соединениями, способными вызывать образование ДНК-аддуктов и разрывы цепей [29]. Данные соединения также известны как индукторы окислительного стресса и воспаления, способные повреждать клеточные мембраны и митохондрии [30]. Однако в представленной работе значимого увеличения фрагментации ДНК не зарегистрировано. Кроме того, отсутствие в водной фазе других летучих органических соединений, потенциально обладающих генотоксической активностью, подтверждает, что в данной экспериментальной модели основным фактором, влияющим на целостность генома, являются ТЧ, а не водорастворимые газовые компоненты. Предположительно, в условиях эксперимента (барботирование дыма через культуральную среду) данные соединения либо не улавливаются водной фазой, либо их концентрация ниже предела обнаружения метода.

Воздействие НФ-ЭТД без разведения привело к 1,6-кратному повышению уровня метилирования по сравнению с Ф-ЭТД (23,5% против 14,5%), однако эти различия не достигли статистической значимости. Полученные результаты позволяют предположить, что ТЧ торфяного дыма могут индуцировать эпигенетические перестройки даже при отсутствии выраженной цитотоксичности и генотоксичности, что требует дальнейшего изучения, в том числе при хроническом воздействии. Тем не менее выявленная тенденция согласуется с данными [26], которые продемонстрировали изменения в метилировании ДНК (преимущественно гипометилирование) в клетках лёгочного эпителия человека BEAS-2B в результате воздействия ТЧ. Авторы связывали эти изменения с активацией сигнальных путей (в частности, Wnt/β-катенин, PI3K/Akt и гипоксия-индуцируемого фактора), ассоциированных с астмой и раком лёгких.

Отсутствие количественного анализа содержания альдегидов не позволяет установить концентрационную зависимость между содержанием этих соединений и наблюдаемыми биологическими эффектами. Поэтому в дальнейших исследованиях должны использоваться альтернативные методы сбора газовой фазы (например, экспозиция клеток на границе «воздух – жидкость»), позволяющие сохранить летучие компоненты, а также количественное определение идентифицированных альдегидов и других потенциально значимых соединений (ПАУ, металлы) для установления их вклада в токсический эффект.

Заключение

В настоящем исследовании впервые проведён сравнительный анализ цитотоксического, генотоксического и эпигенетического действия Ф-ЭТД и НФ-ЭТД на фибробластах мыши 3T3-SV40. Установлено, что однократное воздействие экстрактов не вызывает статистически значимых изменений жизнеспособности клеток, фрагментации и метилирования ДНК. Вместе с тем выявлена тенденция к более выраженному дозозависимому снижению метаболической активности под действием НФ-ЭТД, содержащего ТЧ, по сравнению с Ф-ЭТД. Обнаружено 1,6-кратное повышение уровня метилирования ДНК при воздействии НФ-ЭТД, хотя и не достигшее статистической значимости, что согласуется с данными литературы об эпигенетических эффектах ТЧ и указывает на потенциальную способность компонентов торфяного дыма индуцировать эпигенетические перестройки даже в отсутствие выраженной цитотоксичности и генотоксичности. Идентифицированные альдегиды, вероятно, вносят дополнительный вклад, однако их количественная оценка и изучение синергических с ТЧ эффектов требуют дальнейших исследований. Полученные результаты обосновывают необходимость продолжения экспериментов, направленных на изучение хронического воздействия торфяного дыма.